[发明专利]一种提高过氧化氢酶发酵产量的方法

摘要

本发明提供了一种提高过氧化氢酶发酵产量的方法，是以2009年11月16日已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3449的一株高产过氧化氢酶的Serratia marcesces SYBC08菌株为出发菌种，经种子培养和在产酶培养基中添加100mg/L-200mg/L烟酸作为诱导剂后，调控了菌体的生理代谢，再进行深层发酵，可明显提高过氧化氢酶的活力达1.3倍以上，相当于增加过氧化氢酶产量30％以上，且适用于工业化生产，所产过氧化氢酶可广泛应用于纺织印染、造纸、工业废水处理等领域，属于生物技术领域。

主权项

一种提高过氧化氢酶发酵产量的方法，其特征在于：以已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 3449，分类命名为Serratia marcesces SYBC08为出发菌种，经种子培养和在产酶培养基中添加100mg/L‑200mg/L烟酸作为诱导剂后，再进行深层发酵，可显著提高过氧化氢酶的活力达1.3倍以上，相当于增加过氧化氢酶产量30％以上，且适用于工业化生产，工艺为：(1)种子培养LB平板培养基：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母浸膏5g/L，琼脂25g/L，121℃灭菌30分钟，冷却；种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L，121℃灭菌30分钟，冷却；从斜面上挑取单菌落，划线于LB平板培养基，将平板置于30℃培养箱培养24小时，再从平板上括取两环菌种接种到含50mL种子培养基的250mL三角瓶进行培养，培养条件：pH7.0，培养时间12小时，温度30℃，摇瓶转速200r/min，即为发酵种子液；(2)发酵产酶产酶培养基：20g/L～40g/L玉米浆粉，20g/L～40g/L柠檬酸，100mg/L‑200mg/L烟酸，消泡剂0.2‑0.5g/L，121℃灭菌30分钟，冷却；以2％接种量将发酵种子液接种到含5L产酶培养基的7L发酵罐进行发酵产酶；发酵条件：pH6.5～7.5，温度30～34℃，发酵时间25～30h，转速300～500r/min，通气量1.2～1.7L/min/L；(3)过氧化氢酶提取将发酵液进行离心或过滤，收集的菌体细胞采用高压细胞破碎，破碎机压 力控制在2000bar及以上，破碎菌液按过氧化氢酶活力测定方法测定酶活力并按发酵液等体积计算CAT产量U/ml；(4)酶活的测定方法3ml反应体系中包括粗酶液0.1ml，pH＝7.00的1mol/L Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液2.4ml，新鲜配制的0.12mol/L H2O2溶液0.5ml，以去离子水替代H2O2溶液作为空白对照，以波长240nm体系下吸光度的下降来衡量过氧化氢的酶促降解速度，每隔10s读取一次吸光度值，一般持续进行1min后停止测定，以反应的线性范围计算酶活U/ml，一个标准酶活力定义为：在最适温度下，每分钟分解1μmolH2O2所需的酶量。