[发明专利]一种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法和应用

摘要

一种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法和应用，涉及一种基因工程、生物催化与生物转化。运用重叠延伸PCR技术，将辅酶氧化酶基因与甘油脱氢酶基因融合在一起，形成一个开放阅读框，并构建原核表达系统BL21-pET32a-gdh-nox。利用全细胞催化技术，合成目的产物。所述辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合，在制备由脱氢酶类催化合成目的产物中的应用。利用基因融合技术，克服了脱氢酶类在催化反应时由于辅因子的不断消耗而带来目的产物得率下降的难点，从而大大提高目的产物得率，而且同时利用全细胞催化技术，稳定性好，也可使目的产物易于分离纯化，降低工业生产成本。

主权项

一种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法，其特征在于包括以下步骤：1）产融合酶，具体方法为：将构建好原核表达菌株BL21‑pET32a‑gdh‑nox接种于LB培养基中进行37℃活化12h，按1%接种量转接至新的200mL培养基中，当OD600达0.6～0.8时，加入终浓度为1mM IPTG进行30℃诱导4h，用pH 7.0磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，离心收集菌体，并测定各自酶活性；NADH氧化酶与甘油脱氢酶测定方法如下：超声破碎：将洗涤后的菌体悬浮在缓冲液中，超声破碎功能300W，超声时间4min，随后在4℃下12000rpm离心10min，去除细胞碎片，所得上清即得粗酶液；NADH氧化酶反应体系：90μL pH 7.0磷酸钾缓冲液，10μL粗酶液，终浓度为0.2mMNADH，在340nm每隔6s读取一点，时间为1min；所述NADH氧化酶来源于短乳杆菌（Lactocbacillus brevis ATCC 367）；甘油脱氢酶反应体系：30.0mmol/L(NH4)2SO4、0.2mol/LL甘油、2.0mmol/L NAD+、1.0μmol/L Fe(NH4)2(SO4)2、0.1mol/L碳酸钾缓冲溶液，反应液的总体积为200μL。在340nm每隔6s读取一点，时间为1min；所述甘油脱氢酶来源于克雷柏菌（Klebsiella pneumoniae DSM2026）；所述NADH氧化酶基因与脱氢酶类基因融合；2）全细胞转化：将离心收集到的重组表达菌体，重悬在100～200g/L的甘油溶液中，于三角瓶中转化，温度25℃，转速200rpm，转化时间为8～10h，用二苯胺显色法测定目的产物二羟基丙酮得率。