[发明专利]一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法

摘要

一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，它涉及一种疫苗的制备方法。本发明提供一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，方法为：制备效价为1024以上的金黄色葡萄球菌毒素，效价为128以上的金黄色葡萄球菌类毒素，金黄色葡萄球菌菌体蛋白，无乳链球菌菌苗和大肠杆菌菌苗，经配伍后得到奶牛乳房炎疫苗。本发明的奶牛乳房炎疫苗是安全、无毒的，对攻毒组小白鼠的保护率达到了91.7％。本发明应用于奶牛乳房炎防治领域。

主权项

一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于奶牛乳房炎疫苗的制备方法是按照以下步骤进行的：一、金黄色葡萄球菌毒素制备a、用接种环挑取金黄色葡萄球菌，接种于营养肉汤中，置于37℃培养箱中培养18~24h，得培养液；吸取10μL的培养液于血液琼脂平板培养基上涂布均匀，在37℃培养箱中培养18~24h后，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养琼脂斜面培养基，然后置于37℃培养箱中培养18~24h，得金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物；挑取一接种环金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物，接种于产毒培养基中，在37℃条件下振荡培养18~24h，即为种子液；b、将步骤a得到的种子液按体积百分含量为1％~3%的接种量接种于产毒培养基内，然后在温度为37℃，转速为180~250r/min的条件下培养18~24h后，在3000r/min的条件下离心30min，同时收集上清液与沉淀，收集的上清液即为金黄色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，备用；二、金黄色葡萄球菌类毒素制备c、取步骤一制得的金黄色葡萄球菌毒素，以1N的NaOH溶液调节pH值至6.5~8.5，然后加甲醛至甲醛体积浓度为0.2％~0.5％，置于37℃培养箱中解毒3~7d，即得金黄色葡萄球菌类毒素原液；d、将步骤c得到的金黄色葡萄球菌类毒素原液用滤纸过滤，向滤液中加入医用氯化钠至氯化钠质量浓度为10％~20％，然后以2N的HCl溶液调节pH值至2.0~4.0，静置过夜；e、将步骤d过夜处理后的金黄色葡萄球菌类毒素原液在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀再用无菌重蒸水离心洗涤沉淀1~2次，收集洗涤后的沉淀溶于pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液中，再次在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀并向沉淀中加入质量浓度为1％的硫柳汞溶液至硫柳汞质量浓度为0.01％，即得金黄色葡萄球菌类毒素；其中，磷酸缓冲液与金黄色葡萄球菌类毒素原液体积比为1:15~30；三、金黄色葡萄球菌菌体蛋白的制备取步骤一中收集的沉淀，用0~4℃无菌生理盐水离心洗涤3次，取上清，收集沉淀，将收集的沉淀和无菌玻璃珠按质量比为1:3~5的比例放入无菌匀浆杯中混合，再加入0~4℃无菌生理盐水至杯满，采用匀浆器在温度为5℃，转速为4000r/min的条件下振动12min，然后在转速为14000r/min，温度为5℃的条件下离心40min，收集上清液，用0.5N的HCl溶液调节上清液pH值至3.0~5.0，再次在转速为7000r/min，温度为5℃的条件下离心30min，收集沉淀，装入透析袋中，经48~96h流水透析，即得金黄色葡萄球菌菌体蛋白；四、无乳链球菌菌苗的制备制备菌量为1.5~3.0×109的无乳链球菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；五、大肠杆菌菌苗的制备制备菌量为1.5~3.0×109的大肠杆菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；六、奶牛乳房炎疫苗的制备将步骤二得到的金黄色葡萄球菌类毒素、步骤三得到的金黄色葡萄球菌菌体蛋白、步骤四得到的无乳链球菌菌苗和步骤五得到的大肠杆菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，每毫升奶牛乳房炎疫苗含金黄色葡萄球菌类毒素的效价为10~30U，金黄色葡萄球菌菌体蛋白的蛋白质含量为200~400μg，无乳链球菌的菌数为1.5~3.0×109，大肠杆菌的菌数为1.5~3.0×109。