[发明专利]一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法

摘要

本发明涉及一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法，包括以下步骤：(1)以MS培养基为基本培养基，添加6-BA、NAA、2，4-D等植物生长调节剂；(2)采集中国石蒜幼嫩叶片，灭菌；(3)将叶片片段，接种在合适的培养基上；(4)诱导阶段为暗培养，继代培养阶段和生根培养给予光照；(5)继代培养在小鳞茎达到0.5cm高度时进行；(6)生根培养；(7)驯化炼苗，保持湿润环境，待幼苗叶片伸展，即可进行正常管理。本发明利用中国石蒜叶片建立快繁体系，具有不破坏母鳞茎、保护珍稀种质的优点；得到的幼苗，具有遗传基础一致、性状稳定、生长势整齐等特点，在观赏和药用新品种繁育与利用中具有显著的竞争优势。

主权项

一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法，其技术方案按如下步骤进行：(1)培养基配方和配制适宜外植体幼嫩叶片诱导的培养基配方：MS+6‑BA 20mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L适宜无菌小叶诱导的培养基配方：MS+6‑BA 0.5mg/L+2，4‑D 1.0mg/L+蔗糖30g/L继代培养培养基配方：MS+6‑BA 0.5mg/L+2，4‑D 1.0mg/L+蔗糖30g/L生根培养培养基配方：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L具体的配制方法：A、按照MS培养基配方，把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类，每一类中各种药品分别称量，可按照一定倍数配制浓缩液，然后按照顺序量取所需体积混合在一起，最后加蒸馏水，定容至1升；B、然后加入蔗糖、琼脂，调节ph值至5.9，微波炉加热，煮沸至溶液中琼脂完全溶解呈透明为止；C、将配制好的培养基分装在事先准备好的培养瓶中，1L一般可分装成20‑22瓶，然后盖上盖子并注明标签。最后将用牛皮纸包好的培养皿、滤纸以及蒸馏水一道进行高压灭菌，灭菌温度为121℃，维持时间18‑25min；D、灭菌过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，放置24小时后使用，一般应在灭菌后的两周内用完。(2)叶片采集和处理A：采集中国石蒜幼嫩叶段，采样袋密封带回实验室，清水仔细冲洗，去除叶片表面污物，然后移至接种室；B：选取中国石蒜无菌苗刚长出的嫩叶，在超净工作台上截成1cm左右的片断，直接接种；(3)灭菌和接种将清洗干净的叶段在超净工作台上按下列顺序进行灭菌：75％乙醇中消毒30‑60s→无菌水清洗2次→0.1％ HgCl2溶液中灭菌8‑10min→无菌水清洗4次→无菌滤纸吸干表面水分；然后用解剖刀将叶段切成0.8‑1.0cm的片段，接种在培养基上，以上操作过程在酒精灯火焰30cm范围内进行；(4)培养条件将接种叶片片段的培养瓶整齐摆放在培养架上，诱导阶段为暗培养，温度25±2℃；继代培养阶段和生根培养阶段在光照条件下培养，光照强度1000‑1200lx，光照时间16小时，温度25±2℃；(5)继代培养待叶片组织分化出的白色小鳞茎达到0.5cm高度时，进行继代培养，选用继代培养培养基，转接操作在超净工作台上进行，将小鳞茎上半部切除后，转接于新的培养基上，继代培养可连续培养多代，以实现快速增殖；(6)生根培养继代培养得到的小鳞茎达到0.5cm以上时，即可进行生根培养，将生长势健壮的中国石蒜小苗转接于生根培养基上，待长出3条以上的白色根须后，进行驯化；(7)驯化移栽A、驯化炼苗分两步进行，第一步，每天将培养瓶的盖子揭开一段时间，使幼苗接触外界空气，并逐渐延长时间，大约一周后完全揭开瓶盖；B、第二步，将幼苗取出，用清水清洗，除去附着的培养基，然后修剪较长的根须，移栽于基质中，基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按1∶1∶1配制，保持基质湿润，空气湿度在90％以上，并加盖遮阳网；C、两周后，待幼苗叶片伸展，即可除去遮阳网，进行正常栽培管理。