[发明专利]一种适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法

摘要

一种适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法属农田害虫防控技术领域，包括：将蚜虫加入液氮一起研磨成粉末，加1.5ml冷丙酮，混匀震荡，离心收集沉淀；干燥后的沉淀放入液氮和石英砂后再一次进行研磨，然后加入等体积的饱和酚溶液和SDS缓冲液；离心后吸取的酚相加入5倍体积的0.1M甲醇溶解的乙酸铵溶液，把混合液放到-20℃冰箱中沉淀2小时，沉淀先用甲醇溶解的0.1M乙酸铵溶液洗涤，然后用80％的冷丙酮洗涤，获得蚜虫蛋白粗提物；将蚜虫蛋白粗提物溶解于水化/裂解缓冲液后，离心取上清液，得到蚜虫蛋白双向电泳样品。本发明制备蚜虫蛋白样品简单快速，可获高质量、重复性好的双向电泳图谱，便于生物质谱分析鉴定蛋白，广泛用于蚜虫蛋白质组学研究。

主权项

一种适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法，其特征在于包括下列步骤：1)将蚜虫加入液氮一起研磨成粉末，将粉末放到微量离心管中，每10mg粉末加入1.5ml冷丙酮，混匀震荡后，离心收集沉淀；所述蚜虫与加入液氮的重量比为1：100；2)将步骤1)的沉淀转移到研钵中室温干燥20min，干燥后的沉淀按4：1的重量比加入石英砂，然后按重量比1：100加入液氮再一次研磨；把粉末转移到新的离心管中，再加入等体积的饱和酚溶液和SDS缓冲液后离心；所述饱和酚为Tris饱和酚，其pH为7.9；所述SDS缓冲液配方为：30％蔗糖、2％SDS、pH8.0的0.1M Tris‑HCl和5％β‑巯基乙醇；3)离心后溶液分层，上层的酚层溶液取出后放到新的离心管中，吸取的酚相加入5倍体积由甲醇溶解的0.1M乙酸铵溶液，把混合液放到‑20℃冰箱中2‑4小时，离心后收集沉淀；4)将步骤3)的沉淀先用由甲醇溶解的0.1M乙酸铵溶液洗涤2次，然后用80％的冷丙酮洗涤2次，真空离心干燥1min，得到蚜虫的蛋白粗提物；5)将蚜虫的蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液混合，在30℃条件下水浴30min促进蛋白的溶解，然后在4℃条件下15000×g离心5min，收集上清液，即得到适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品；所述蚜虫蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液的质量体积比为200mg/100uL‑400mg/100uL。