[发明专利]一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤：1）转基因香石竹Moonshade基因组DNA的提取；2）转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列的分离和确认；3）转基因香石竹Moonshade定性PCR检测；4）转基因香石竹Moonshade定量PCR检测。本发明建立了适用于转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，并验证了该检测方法的特异性和灵敏度，为转基因香石竹的进口检测、监管及环境安全评价提供重要依据。

主权项

一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤：1）转基因香石竹Moonshade基因组DNA的提取；2）转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列的分离和确认：利用LM‑PCR方法分离得到包括如SEQ ID No1所示的194bp未知序列和130bp的外源插入载体序列；根据该未知序列设计引物GenomeC1F/GenomeC1R进行PCR扩增，PCR扩增结果证明如SEQ ID No1所示的序列为香石竹基因组序列，即转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列如SEQ ID No1所示；3）转基因香石竹Moonshade的定性PCR检测：采用Moonshade品系特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R进行定性PCR扩增；4）转基因香石竹Moonshade的定量PCR检测：由转基因香石竹Moonshade基因组DNA作为标准品，采用Moonshade品系特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade‑Probe进行定量PCR扩增，同时，采用内标准基因ans特异性定量引物对ANS‑F2/ANS‑R2序列和探针ANS‑Probe进行内标准基因定量PCR，并建立品系特异性定量标准曲线和内标准基因ans的定量标准曲线；再利用相对定量法对样品进行定量检测；其中，引物GenomeC1F/GenomeC1R，其序列分别如SEQ ID No2和SEQ ID No3所示；引物对shadeC1F/shadeC1R序列分别如SEQ ID No4和SEQ ID No5所示；定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade‑Probe序列分别如SEQ ID No6、SEQ ID No7和SEQ ID No8所示；内标准基因ans特异性定量引物对ANS‑F2/ANS‑R2序列和探针ANS‑Probe序列如SEQ ID No9、SEQ ID No10和SEQ ID No11所示。