[发明专利]一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法

摘要

一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。本发明以酶活保留率和相对酶活力为依据，修饰酶液的酶活保留率为105.81%，丁二酸酐（SA）对氨肽酶的平均氨基修饰率为55.86%。和原酶液相比，修饰酶液的最适反应温度从60℃提高到65℃，最适反应pH从8.5提高到9.5~10.0，70℃保温5小时后仍然能保留70%以上的活性，说明其热稳定性显著提高；动力学参数Km降低到0.75mmol·L-1，说明修饰后氨肽酶对底物的亲和力有明显的提高。SA化学修饰是一种可明显提高枯草芽孢杆菌氨肽酶与底物的亲和力及其热稳定性的有效方法，较好改善枯草芽孢杆菌氨肽酶的应用特性，对推动该酶今后的工业化生产和进一步的应用有积极的作用。

主权项

一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法，其特征在于：A、丁二酸酐对氨肽酶的化学修饰方法（1）称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris‑HCl缓冲液中，然后向混合液中缓慢加入10mg的丁二酸酐SA，搅拌溶解，在整个反应过程中用2mol/L NaOH溶液维持反应体系的pH值为8.0，在4℃条件下反应1h，反应结束后，用0.05mol/L、pH8.5的Tris‑HCl缓冲液在4℃透析过夜，以除去多余的修饰剂，得到丁二酸酐修饰的氨肽酶，修饰酶液简称SA‑AE，4℃冰箱保存；（2）称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris‑HCl缓冲液中，用0.05mol/L、pH8.5的Tris‑HCl缓冲液在4℃透析过夜，得到原酶液AE，4℃冰箱保存；B、修饰前后酶的部分酶学性质（1）采用丁二酸酐对氨肽酶在优化条件下进行化学修饰，SA对AE的平均氨基修饰率为55.86%，酶活保留率为105.81%；（2）动力学参数Km：原酶液Km为1.0 mmol·L‑1，修饰酶液Km降低到0.75mmol·L‑1，说明修饰后氨肽酶液对底物的亲和力有明显的提高，最大反应速度Vmax均为2500mmol·L‑1·min‑1；（3）原酶液和修饰酶液的最适温度：原酶液的最适温度为60℃，修饰酶液的最适温度提高到65℃；（4）原酶液和修饰酶液的温度稳定性：修饰酶液70℃保温5h后仍然能保留70%以上的活性，原酶液70℃保温5h同等条件下的酶活残留率仅为35%；（5）原酶液和修饰酶液最适pH：原酶液的最适pH为8.5，修饰酶液的最适pH提高到9.5~10.0；（6）原酶液和修饰酶液的pH稳定性：以最高酶活的80%为界确定酶的pH稳定范围，原酶液在pH7.0~9.0范围内，酶活力较高且稳定，在相同条件下，修饰酶液在pH6.0~9.0范围内较稳定。