[发明专利]小鼠肝窦内皮细胞的提取方法

摘要

本发明公开了一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，该方法利用氯化钆注射清除枯否细胞，结合两步灌流、差速离心、percoll离心、差速贴壁的来实现敢斗内皮细胞的分离。小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，简单易行、细胞纯度高、获得率高，并在体外培养保留完整的结构和功能活性，可用于生化及免疫学。此外，本发明方法使用实验室常规仪器，成本低可在大部分实验室推广。

主权项

一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，包括以下步骤：1）选取小鼠尾静脉注射氯化钆溶液，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比为10~20mg/25g，连续注射两日后进行手术，术前一天禁食；2）消毒器械及动物工作台，36~38℃预温D‑hanks液，1640培养液及胶原酶IV溶液； 3）选取小鼠腹腔注射戊巴比妥钠及肝素钠，戊巴比妥钠的日注射量和小鼠体重之比为40~100mg/kg，肝素钠40~60U/只；4）待小鼠完全麻醉后固定于动物手术台，消毒小鼠腹部，无菌纱布铺巾防止污染；5）取正中切口进腹，撑开腹腔，将肠管拨向左下腹，暴露门静脉及下腔静脉；6）连接五十毫升注射器、灌注泵、延长管及静脉留置针，开启灌注泵，让预温的D‑hanks液充满延长管及静脉留置针，排净空气；7）静脉留置针穿刺门静脉，成功后拔出针芯，双重丝线结扎，D‑hanks液被泵入门静脉，观察到肝脏颜色变成土黄色时，剪开下腔静脉，调整灌流速度为30ml/h；8）依次剪开肝脏周围韧带及膈肌，将肝脏迅速完整的分离下来，勿损伤肝脏，将其置于预先放置了36~38℃D‑hanks液的培养皿中，持续D‑hanks液灌注25~40min；9）然后，将灌流液体换为预温的胶原酶IV溶液，调整灌流速度为15~17ml/h，灌流20~30min后，拔出静脉留置针，将肝脏置于胶原酶IV溶液中于37℃温箱放置10~20min； 10）从温箱中取出肝脏，将肝脏置于100目滤网上，减去胆囊及与肝脏相连的膈肌、韧带、肝门区血管，无损伤镊剥离肝包膜，挑去其中脉管系统，用预温的1640培养液反复冲洗将细胞滤过滤 网；11）过滤后的细胞悬液低速50g离心3min，使肝脏实质性细胞沉淀，取上清液以800g离心10min后，取细胞沉淀以3毫升1640培养液重悬，得细胞悬液备用；12）在离心管中，分别铺3ml的50%percoll溶液，3ml的25%percoll溶液，及3ml细胞悬液，常温离心1200g，20~40min； 13）取两层percoll液体之间的细胞层，用1640培养液重悬混匀后，2000rmp离心10min，去掉上清，所得沉淀用1640培养液重悬并同样条件再离心一次，取沉淀得到待培养细胞，在体积百分比浓度为20%的胎牛血清中培养； 14）观察待培养细胞的贴壁状态，待细胞贴壁1小时后，取未贴壁细胞悬液于新容器中培养，12小时后换液，去除未贴壁细胞及死亡细胞，即为肝窦内皮细胞；其中，所述胶原酶IV溶液的质量浓度为0.05~0.1%。