[发明专利]一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法

摘要

本发明提供了一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法，采用的发酵菌株是2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2010235的高产漆酶的密孔菌属的Pycnoporus sp.SYBC-L3菌株，该发明的特点是以被列为世界十大害草之一的水葫芦和木屑为主要原料固态发酵生产制备漆酶，用DMP法测酶活，漆酶活力为73.61U/g干基，成本低廉且可变废为宝，简便易行。所产漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等领域，属于生物技术领域。

主权项

一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法，其特征是以2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC‑L3高产漆酶的密孔菌属菌株为出发菌株；以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵制备漆酶；工艺为：(1)种子培养种子培养基：以质量体积浓度计：2％葡萄糖和20％马铃薯；马铃薯需切成片或块，加水煮20‑30分钟，用纱布过滤取其汁；接种工艺：取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30℃培养7天，切取3块直径大小为0.7CM左右的菌落接入装有50ml种子培养基的250ml规格的三角瓶中，再加入玻璃珠10粒，准备若干份，置于摇床，培养条件：转速200rpm，温度30℃，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子液；(2)发酵产酶培养基将木屑也60℃烘箱中烘干至恒重；水葫芦晾晒，60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎成丝状；称水葫芦20g，木屑11g放入500ml的三角瓶中，加入用盐酸及氢氧化钠调PH＝3.5的水60ml，再加入CuSO4·5H2O 1.5mmol/L，没食子酸40μmol/L，121℃灭菌20分钟，冷却后待用；(3)发酵产酶及酶液提取灭菌冷却后在发酵产酶培养基中加入20ml种子培养液并充分与木屑和水葫芦混合，并用8层纱布封口置于30°环境中静止培养8天后，首先再加入400ml水，将结成团的菌块搅散后进行搅拌或置于摇床在30℃、200rpm条件下继续培养2小时，然后在30°环境中静止15小时，最后用离心机离心或用抽滤方法或用纱布进行过滤除去固型物和菌体即得到漆酶粗酶液，用DMP法测酶活，并计算总酶活除木屑和水葫芦的重量，得到干物质产漆酶的单位U/g；(4)酶活的测定方法3mL反应体系中包括：0.5ml10mmol/L的2，6‑二甲氧基酚；2.4ml pH＝3.0的0.1mol/L磷酸氢二钠‑柠檬素缓冲液；0.1ml粗酶液——发酵液经冷冻高速离心机10000g离心10分钟得到上清液并视酶活力稀释，以去离子水替代粗酶液溶液作为空白对照，在469nm处测吸光值每隔5s读取一次吸光度值，一般持续进行1min后停止测定，以反应的线性范围计算酶活；酶活力定义：以每分钟氧化1μmol的DMP即2，6‑二甲氧基酚转化成3，5，3′，5′‑四甲氧基二苯醌所需要的酶量，系数ε＝9.6L/(mmol·cm)，定义为1个酶活力单位，酶活性以U·L‑1表示。