[发明专利]用普鲁士蓝平板定量测定L-氨基酸氧化酶活力的方法

摘要

本发明公开了一种利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法：用打孔器在普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为4~10mm的小孔，然后将小孔中加入待测液，室温静置10~300min，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的直径，根据过氧化氢与蓝色圈直径制作的标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L-氨基酸氧化酶活力；所述待测液以交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas sp.B3）发酵培养获得的酶为酶源，以L-氨基酸为底物，25～50℃，pH为5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液即为待测液；本发明方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，稳定性高等特点。

主权项

用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L‑氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述方法为：（1）普鲁士蓝琼脂平板的制备：将10~30g/L氯化铁水溶液与10~30g/L铁氰化钾水溶液以体积比0.2~6:1混合制成混合液，然后将混合液与MM琼脂液以体积比1:5~20混合摇匀，在115℃下灭菌30min，倒平板，制成所述普鲁士蓝琼脂平板；所述MM琼脂液终浓度组成为：酵母膏0～10g/L、蛋白胨2～20g/L、琼脂15～30g/L，pH 5～9，溶剂为水；（2）L‑氨基酸氧化酶活力的测定：取步骤(1)制得的普鲁士蓝琼脂平板，用打孔器在所述普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为4~10mm的小孔，然后将小孔中加入待测液，室温静置10~300min，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的直径，根据过氧化氢与蓝色圈直径标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L‑氨基酸氧化酶活力；所述的过氧化氢与蓝色圈直径的标准直线是以所取用步骤(2)同样的普鲁士蓝琼脂平板以梯度浓度的标准过氧化氢为测试样品做与待测液平行试验取得的数据得到的标准浓度的过氧化氢与蓝色圈直径线性关系图；所述待测液的制备方法为：以交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas sp.B3）发酵培养获得的酶为酶源，以待测L‑氨基酸为底物，25～50℃，pH 5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液即为待测液；所述酶来自于交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述L‑氨基酸初始底物浓度为2～20mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0.5～10mg湿菌体/mmol底物；所述L‑氨基酸氧化酶活力的定义为：30℃下，1mL酶液作用底物浓度为5mmol/L的L‑氨基酸1h后释放出1mmol/L过氧化氢即为1个酶活单位（U）。