[发明专利]一种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒由以下物质组成：a）一种甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9;b）一种特异性强的抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体；c）抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体制备成抗体阻断ELISA核心试剂盒；d）盒体内的样品稀释液、10倍洗涤液、底物液A、底物液B、反应终止液，阳性对照样品和阴性对照样品。还公开了一种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒在甲型H1亚型流感病毒抗体检测中的应用。具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，操作简单易行，不需由专业人员操作。试剂盒稳定性好、保存期长，解决了甲型H1亚型流感病毒抗体检测的问题。

主权项

一种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒由以下物质组成：a）一种甲型H1亚型流感病毒 A‑Influ/JML‑F9;b）一种特异性强的抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体；c）抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体制备成抗体阻断ELISA核心试剂盒；d）盒体内的样品稀释液、10倍洗涤液、底物液A、底物液B、反应终止液，阳性对照样品和阴性对照样品；其中：所述的试剂组分及其配比如下：（1）样品稀释液的配制： PBS+TritonX‑100+3%BSA；在121℃高压蒸汽下灭菌30分钟后分装，置4℃贮存；（2）阳性血清的制备：选用4周龄健康仔猪，免疫前采血用血凝抑制试验方法检测阴性后，隔离观察7日,将甲型H1亚型流感病毒悬液甲醛灭活后，加入等量的佐剂乳化作为免疫原,通过颈部肌肉注射途径进行3次免疫，每次剂量分别为2mL、2mL、4mL，免疫间隔时间为21日,末次免疫后7～10日采血并分离血清，进行HI试验检测抗体效价,免疫猪抗体HI效价达到1:320时，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清备用,取备用血清经56℃灭活30分钟后用样品稀释液稀释，调整到ELISA方法检测OD630nm值为0.8～1.6之间,按血清量的0.01％体积比加入硫柳汞，0.45µm滤膜过滤除菌,无菌分装，每管1mL；（3）阴性血清的制备：选用4周龄健康仔猪，经血凝抑制试验检测为甲型H1亚型流感病毒抗体阴性，隔离观察7日后，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心并分离血清备用,取备用血清经56℃灭活30分钟后用样品稀释液适当稀释，调整到ELISA方法检测OD630nm值低于0.2,按血清量的0.01％体积比加入硫柳汞，0.45µm滤膜过滤除菌,无菌分装，每管1mL；（4）底物液A：0.006%H2O2缓冲液；（5）底物液B：取Na2HPO4•12H2O 14.2 g，柠檬酸10.5g,用ddH2O定容至500mL成0.1mL磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.0；按终浓度为20mg/L添加联苯二胺；（6）反应终止液：0.025% 体积比氢氟酸；HF 625μL，用ddH2O定容至100mL；（7）10倍洗涤液： NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4•12H2O 29g，KH2PO4 2g，Tween‑20 5mL，用ddH2O定容至1000mL ，pH7.4。