[发明专利]小泛素样修饰的生物检测方法

摘要

发明涉及一种小泛素样修饰的生物检测方法，通过构建小泛素样修饰蛋白与绿色荧光蛋白的基因融合体，将基因融合体与目标蛋白在细胞内的共表达再通过免疫沉降的方法收集目标蛋白，最后对目标蛋白进行单分子检测是否发生小泛素样修饰。该方法在免疫沉降收集到目标蛋白之后即进行洗脱并进行观察，实验步骤大大减少，可以缩短实验时间；此外，由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片上100nm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，可以对小泛素样修饰进行单分子水平上的检测，因此具有迅速、灵敏的特点。

主权项

一种小泛素样修饰的生物检测方法，其特征在于，包括如下步骤：扩增小泛素样修饰蛋白基因，在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，得到含有小泛素样修饰蛋白基因‑绿色荧光蛋白基因的融合体基因；将2.5微克所述融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞内，并在细胞内共表达，得到含有小泛素样修饰蛋白‑绿色荧光蛋白及目标蛋白的细胞，其中，所述细胞是人胚肾细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞或人成骨肉瘤细胞；将目标蛋白特异性的抗体与用蛋白A/G偶联的树脂进行孵育处理，制备抗体‑树脂复合物；加入裂解液并破碎所述细胞，得到的细胞裂解液离心后取上清液；向所述抗体‑树脂复合物中加入所述上清液，孵育，使目标蛋白与所述目标蛋白特异性抗体结合，接着清洗所述抗体‑树脂复合物，之后使用与抗体‑树脂复合物等体积的pH 2.6、浓度为0.1mol/L的甘氨酸溶液洗脱所述抗体‑树脂复合物，得到洗脱液；对所述洗脱液使用Tris缓冲液稀释100至500倍，得到稀释液；使用全内反射荧光显微镜在488nm激光器激发的条件下对所述稀释液进行单分子检测，若观察到有荧光分子表明目标蛋白发生小泛素样修饰；若没有观察到荧光分子则表明目标蛋白没有发生小泛素样修饰。