[发明专利]利用SSR引物鉴定大麦品种的方法及其应用

摘要

本发明涉及一种利用SSR引物鉴定大麦品种的方法，包括提取供试品种样品的DNA，用14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，SSR谱带分析，其中：所述的供试品种样品至少为两个大麦品种，当品种间差异位点数≥3，判定为不同品种；当品种间差异位点数为1或2，判定为近似品种；当品种间差异位点数为0，判定为疑同品种。本发明可以用于对供试大麦品种与已知大麦品种进行品种鉴定，或构建大麦品种数据库。具有高效、准确、低成本、操作方便等优势，有效的对大麦种子真伪进行监控，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场。

主权项

1.一种利用SSR引物鉴定大麦品种的方法，包括提取供试品种样品的DNA、用SSR引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，SSR谱带分析，其特征在于：所述的供试品种样品至少为两个大麦品种，所述的SSR引物包括14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物，其中，14对基本核心SSR引物为Bmag0211、Bmag0378、Bmag0711、Bmac0209、Bmag0877、EBmac0701、EBmac0635、Bmag0353、Scssr10148、Scssr03907、Bmag0009、Bmag0867、HVCMA和EBmac0603对应的引物，14对扩展核心SSR引物为Scssr02748、HVM54、Scssr07759、HvXan、HVM27、HVM60、HVM40、Bmac0181、Scssr07106、Bmag0387、Bmac0018、Scssr09398、Bmac0064和Scssr15864对应的引物；具体步骤如下：提取供试品种样品的DNA；用14对基本核心SSR引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积为25μL，扩增反应体系为：SuperTaq®5U/μL的DNAPolymerase0.2μL，2.5mmol/L的dNTP2μL，含Mg²⁺的10×PCRBuffer2.5μL，10μmol/L的每对引物的上游和下游引物各1μL，供试大麦品种基因组20ng/μL的DNA模板1μL，双蒸水补足25μL；PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环，94℃30sec，47～62℃30sec，72℃1min，72℃延伸5min，4℃保存；供试大麦品种PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%，凝胶组分为：6%变性聚丙烯酰胺溶液60mL，TEMED50μL,10%过硫酸胺500μL；设定功率50W，1×TBE缓冲液电泳2h，关闭电源，进行染色；染色过程是：10%冰醋酸溶液固定20min，超纯水迅速水洗，0.2%硝酸银溶液银染30min，超纯水再次迅速水洗，显影液显色数分钟，直至条带清晰，10%冰醋酸溶液终止5min，超纯水再次水洗；通过分析基本核心SSR结果，大麦品种间多态性位点的差异，确定等位变异数及多态性信息含量，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，构建大麦品种的SSR分析谱带数据，利用这些数据对来源不明的大麦品种进行比较,如果品种间差异位点数≥3，判定为不同品种，形成鉴定结果；如果品种间差异位点数小于2,则转入e步骤；再用14个扩展核心SSR引物对采用供试品种模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积和扩增反应体系均与b步骤相同；并按照d步骤进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染；综合分析基本核心SSR和扩展核心SSR引物的结果，确定等位变异数及多态性信息含量，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，构建大麦品种的SSR分析谱带数据，品种间差异位点数≥3，判定为不同品种；品种间差异位点数为1或2，判定为近似品种；品种间差异位点数为0，判定为疑同品种，形成鉴定结果；所述的6%变性聚丙烯酰胺溶液为420g尿素，10×TBE50mL，40%PAG150mL，去离子水定容至1000mL；所述的10%冰醋酸溶液是将100mL冰醋酸，加入1000mL去离子水；所述的0.2%硝酸银溶液是将2.0g硝酸银，溶于1000mL去离子水中；所述的显影液是将15g氢氧化钠溶于1000mL去离子水中，再加入5mL甲醛。