[发明专利]绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法

摘要

绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法，涉及生物工程技术领域。步骤：确定内参基因的方法；取一定量的RNA提取物，用ddH2O稀释2-10倍；其次，取50ng/μL的RNA样品作为模板，采用cDNA合成试剂盒进行反转录合成cDNA；再次，以反转录合成cDNA为模板，分别以6个内参基因为引物；最后，采用geNorm程序计算6个内参基因标准化因子Vn/n+1的配对差异分析从而判定最适内参基因的数目。本发明解决了目前还没有对中国美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作为皮肤组织内参基因筛选方法的问题。本发明利用SYBR Green I特异性与双链DNA结合发出荧光的特性，建立了中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织中GAPDH基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。

主权项

绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：一、确定内参基因的方法：以绵羊皮肤组织为试验样品，首先，取10‑20mg皮肤组织组织液氮中彻底研磨，RNA提取试剂盒对皮肤组织样进行总RNA提取，1％琼脂糖凝胶电泳，0.5×TBE电泳缓冲液，100V，15min来检测RNA完整性；二、取一定量的RNA提取物，用ddH2O稀释2‑10倍，用ddH2O将分光光度计调零，取稀释液进行测定RNA纯度，取OD260/OD280读数在1.8‑2.0之间的RNA样品进行后续试验，计算RNA终浓度(ng/μL)＝(OD260)×(稀释倍数2‑10)×40；三、其次，取50ng/μL的RNA样品作为模板，采用cDNA合成试剂盒进行反转录合成cDNA，参考GenBank中绵羊相应基因的核苷酸序列，分别设计并合成18S rRNA、β‑Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP这6个内参基因的引物；四、再次，以反转录合成cDNA为模板，分别以6个内参基因为引物，采用SYBR Green I荧光染料试剂盒，进行优化条件的实时荧光定量PCR，每个分析对象均取3次重复实验数据的平均值，每次实验用ddH2O作为阴性对照，读取实时荧光定量PCR仪系统检测的每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，即Ct值；五、最后，采用geNorm程序计算6个内参基因标准化因子Vn/n+1的配对差异分析从而判定最适内参基因的数目，同时，统计分析各内参基因的表达稳定度平均值，即M值，并对其进行排序，M值越小，基因表达越稳定，最终筛选出在绵羊皮肤组织中表达最稳定的内参基因是18S rRNA、β‑Actin、GAPDH三个内参基因。