[发明专利]一种液固双重发酵制备高密度微生态制剂的方法

摘要

本发明属于生物工程制备技术领域，涉及一种液固双重发酵制备高密度微生态制剂的方法，包括液体菌液的培养、固体基料的配制和固体基料与液体菌液的混匀三个功能性过程，先对枯草芽孢杆菌进行液态发酵至对数生长期，再配用同重量的固体发酵基质相混合，实现大剂量菌液接种，然后再次进行固体发酵而制得高浓度菌体制剂，称之为液固双重发酵法；枯草芽胞杆菌从海参肠道和周围生活环境中分离的在体外对海参腐皮综合症致病菌有拮抗作用的土著菌株，对海参腐皮综合症有针对性的作用，其应用有着非常广阔的市场；其制备工艺简单并易于控制，不易染杂菌，菌株浓度高，加工成本低，生产环境友好。

主权项

一种液固双重发酵制备高密度微生态制剂的方法，其特征在于包括液体菌液的培养、固体基料的配制和固体基料与液体菌液的混匀三个功能性过程，其具体工艺步骤包括：（1）平板培养：枯草保存菌种划线接种至平板培养基，其培养基配料为大豆蛋白胨3g，NaCl20g，葡萄糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121℃灭菌，37℃培养24h；（2）试管接种：取生长良好、菌落典型的菌株接种10ml，其培养基配料为大豆蛋白胨3g，NaCl20g，葡萄糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121℃灭菌，37℃培养40h；（3）三角瓶接种100ml，其培养基同步骤（2），121℃灭菌，37℃培养36h；（4）三角瓶接种1000ml，其培养基同步骤（3）；（5）10L种子发酵罐，培养液7.5L，培养基同步骤（3），pH值为7，121℃灭菌30分钟，培养温度为37℃，时间为24h，转速150r/min，通气量0.4vvm，指每分钟通入单位发酵体积m3的空气体积m3；（6）100L种子发酵罐，培养液75L，培养基按葡萄糖1.5g，豆粕粉3g，淀粉1g，30.8mg/L的硫酸锰1g，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g,酵母膏0.2g，氯化钠20g，水1000ml的比例配制，按步骤（5）方法培养；（7）2000L发酵罐，培养液为1500L，培养基同步骤（6），发酵方法同步骤（5），培养36h；得发酵液（8）选择固体基质为豆粕粉1000kg，蒸煮灭菌，待冷却至35℃时，加入步骤（7）中的发酵液900kg，固体基质重量与液体发酵液重量比为1：1，搅拌均匀后装盘，入无菌培养室，恒温40℃，通风，浅盘发酵36小时，中间翻料3次，发酵结束后提高温度至60℃，加大风量，干燥，粉碎即得产品高密度微生态制剂。