[发明专利]使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法

摘要

本发明涉及使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法，以细菌过氧化氢酶保守区设计四种简并引物的组合，以聚合酶链式反应扩增海水总DNA中的过氧化氢酶基因片段，再以大肠杆菌构建酶基因片段的文库，使用限制性内切酶对文库中的酶基因进行酶切，电泳检测片段的分子量分布，确定不同的电泳条带类型，最后对不同类型的过氧化氢酶基因分别进行测序，可获得过氧化氢酶基因多样性的信息。该方法是一种精确、可靠、快速、使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的新方法,可用于检测海水中细菌过氧化氢酶多样性。

主权项

一种使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法,其特征在于包括下述步骤：1）、从GenBank搜集各类已知的细菌过氧化氢酶蛋白序列，进行多序列比对后，找出保守的氨基酸序列，由此获得合适的四种简并引物,四种简并引物均根据过氧化氢酶蛋白序列的保守区设计，四种简并引物序列包括两种正向简并引物序列(5’至3’)为：C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG；CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG；和两种反向简并引物序列(5’至3’)为：CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC；C3‑:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCR;2)使用步骤1)中四种简并引物任一组合，聚合酶链式反应扩增过氧化氢酶基因片段,PCR扩增使用12.5微升反应体系：所述反应体系为2.5mM脱氧核糖核苷三磷酸1微升，10×水生栖热菌DNA聚合酶PCR缓冲液1.25微升，50μM的两种简并引物各0.1至0.2微升，水生栖热菌DNA聚合酶0.5至0.7U，海水DNA 1微升，加水至总体积12.5微升;制备过氧化氢酶基因片段时每次使用4至8个12.5微升PCR扩增体系;PCR扩增条件：94℃1至2分;94℃20至40秒,60℃→51℃50至80秒,72℃1分30秒,10至15个循环，每循环降低退火温度1℃；94℃20至40秒,50℃50至80秒,72℃1分,20循环；72℃3分。反应后合并各管PCR扩增产物，纯化分子量在500bp至1000bp的单一PCR扩增产物;3)使用T载体试剂盒连接步骤2)的PCR扩增产物，转化大肠杆菌感受态细胞构建过氧化氢酶的基因片段的T载体文库,蓝白斑筛选;挑取所有菌落扩增，使用相应的过氧化氢酶简并引物进行菌落PCR扩增寻找阳性克隆;琼脂糖凝胶电泳确认目标PCR扩增产物即过氧化氢酶基因片段;4)向步骤3)的所有目的PCR扩增产物中加入限制性核酸内切酶MboI及其缓冲液，酶切后使用琼脂糖凝胶电泳检测所有酶切反应液中的核酸片段，每一种特异的不重复的电泳条带类型对应着一种过氧化氢酶基因，确定过氧化氢酶基因的种类数以及每种基因的数目;5)对于步骤4)确定的每种过氧化氢酶基因，选择一个对应的步骤3）中的PCR扩增产物进行DNA测序，获得所有种类的过氧化氢酶基因的序列;这些序列和过氧化氢酶基因种类及数目构成了海水中细菌过氧化氢酶多样性的信息。