[发明专利]小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达

摘要

一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，属于分子生物学技术领域，其表达是：以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增了末端含有EcoRI和XhoI酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件VectorNTI对所测定序列与对应的NCBI序列进行比对分析，确定该基因为Mces1f。通过EcoRI和XhoI进行双酶切，使Mces1f基因经T4DNA连接酶作用连接在大肠杆菌高效表达载体酶切位点上构建重组质粒PET-32a-Mces1f。有益效果是：利用本发明构建的工程菌及其产生的重组酶降解环境中的农药残留物，改善环境，它与其他的降解方法相比酶制作方法简单，生产成本低且降解效率高。

主权项

1.一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，其表达是：（1）.以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增了末端含有EcoR I和Xho I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector NTI对所测定序列与对应的NCBI序列进行比对分析，确定该基因为Mces1f；EcoR I 起始密码子GAATTCATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCTGGTGTCTCTAGCAACCTGTGTGATTTGCGGAAATCCCTCTTCACCACCTGTGGTAGACACTGCTCATGGTAAAGTCCTGGGGAAACACGTGAACGTAGAAGGATTTTCACAGCCTGTGGCCGTCTTCCTGGGAATCCCCTTTGCCAAGCCCCCTCTTGGATCCCTGAGGTTTGCTCCACCACAGCCTGCAGAGCCCTGGAGCTCAGTGAAGAATGCCACCACCTACCCACCTATGTGCTCCCAAGATGCAGCTAGAGGACAGGCGGTCAATGACCTCATAACCAATAGAAAGGAGAAAATCCATCTTGAATTTTCTGAAGATTGCCTGTACCTAAATATTTACACTCCTGCGGACTTTTCAAAGAACAGTAGGCTACCGGTGATGGTGTGGATCCATGGAGGTGGACTGAAGCTGGGTGGGGCATCAAGCTTTGATGGACGGGCTCTCTCTGCATACGAAAATGTGGTGGTGGTGGCCATTCAATATCGCCTGAGTATCTGGGGATTCTTCAGCACAGGGGATGAACACAGTCGGGGAAACTGGGGTCATTTGGACCAAGTGGCTGCTCTGCATTGGGTCCAGGACAACATTGCCAACTTTGGCGGGGACCCAGGCTCTGTGACCATCTTTGGAGAGTCAGCAGGAGGTTACAGTGTCTCAATTCTTATATTGTCCCCATTGTCCAAGAACCTCTTCCACAGTGCCATTTCTGAGAGTGGTGTGGCCTTCATTCCTGGAATGTTTACCAAAGATGTGAGGCCAATTACTGAGCAAATTGCTGTTACTGCTGGCTGTAAGACCACCACGTCTGCCGTCATTGTTCACTGCATGCGCCAGAAGACGGAGGAGGAGCTATTAGAGATCATGCATAAATTGAATCTGTATAAACTGAGTTTACAAGGAGATACCAAAAATAGCGACCAGTTCGTGACAAGTGTGCTTGATGGAGTGGTGCTACCAAAGGACCCCAAAGAGATCCTGGCTGAGAAGAACTTCAACACTGTGCCTTACATTGTGGGAATCAACAAGCAAGAATGTGGCTGGCTTCTGCCAACAATGACGGGATTTCTACCAGCTGATGTAAAATTGGACAAGAAGAAAGCCATTGCACTCCTGGAGCAATTTGCTTCCATGACTGGCATACCAGAGGATATTATTCCAGTTGCTGTTGAGAAGTACACAAAAGGTAGTGATGACCCTGATCAGATCAGAGAGGGAGTTCTCGACGCAATGGGGGATGTGGCATTTGGTGTTCCATCGGTGATTGTGTCCCGTGGCCACAGAGACACTGGAGCTCCCACCTACATGTATGAGTATCAATACTACCCAAGCTTCTCATCACCCCAAAGACCCAAGAATGTAGTAGGAGACCATGCAGATGATGTCTACTCTGTCTTCGGTGCTCCAATTTTAAGAGAGGGTGCCTCCGAAGAGGAGATCAATCTCAGCAAGATGGTGATGAAATCCTGGGCCAACTTTGCTCGGAATGGGAACCCTAATGGCAAAGGGCTGCCTCATTGGCCAAAGTATGATCAGAAAGAAGGATATCTTCATATTGGTGGCACCACCCAGCAAGCCCAGTGACTGAAGGAGGAGGAAGTGACTTTCTGGACACAGTCCCTTGCCAAGAAACAACCCCAGCCATACCACAATGAGCTGTGACTCGAG终止密码子 Xho I（2）.通过EcoR I和Xho I进行双酶切，使Mces1f基因经T4 DNA连接酶作用连接在大肠杆菌高效表达载体PET-32a的EcoR I和Xho I酶切位点上构建重组质粒PET-32a-Mces1f，转化表达宿主菌BL21,进行IPTG诱导表达；此酶是由535个氨基酸残基组成的，由于选PET-32a作为表达载体，SDS-PAGE显示分子量为76.9KD，跟预期一样；MFLSTLFLVSLATCVICGNPSSPPVVDTAHGKVLGKHVNVEGFSQPVAVFLGIPFAKPPLGSLRFAPPQPAEPWSSVKNATTYPPMCSQDAARGQAVNDLITNRKEKIHLEFSEDCLYLNIYTPADFSKNSRLPVMVWIHGGGLKLGGASSFDGRALSAYENVVVVAIQYRLSIWGFFSTGDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQDNIANFGGDPGSVTIFGESAGGYSVSILILSPLSKNLFHSAISESGVAFIPGMFTKDVRPITEQIAVTAGCKTTTSAVIVHCMRQKTEEELLEIMHKLNLYKLSLQGDTKNSDQFVTSVLDGVVLPKDPKEILAEKNFNTVPYIVGINKQECGWLLPTMTGFLPADVKLDKKKAIALLEQFASMTGIPEDIIPVAVEKYTKGSDDPDQIREGVLDAMGDVAFGVPSVIVSRGHRDTGAPTYMYEYQYYPSFSSPQRPKNVVGDHADDVYSVFGAPILREGASEEEINLSKMVMKSWANFARNGNPNGKGLPHWPKYDQKEGYLHIGGTTQQAQ采用Ni-柱亲和层析，对Mces1f的表达产物进行了纯化，获得了高纯度90%以上的Mces1f。