[发明专利]基因共转染技术建立的白血病小鼠模型及其制备方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因共转染技术移植建立白血病小鼠模型及其制备方法。本发明提供了一种白血病小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：一、进行K-ras突变体与AML1-ETO融合基因慢病毒载体构建与包装；二、骨髓细胞分离及病毒感染情况监测；三、感染细胞植入小鼠建立白血病动物模型；四、模型鉴定。本发明率先采用了尾静脉注射导入人工定点突变K-ras突变体与AML1-ETO融合基因共转染骨髓细胞的方式建立白血病小鼠模型的方法，本发明提供的白血病小鼠模型，成功率高，病理特征与临床白血病的发病状况相似性高，可以为白血病髓外浸润机制研究，白血病药物筛选，基因和分子靶向治疗提供新的动物模型。

主权项

一种基因共转染技术建立的白血病小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：A、K‑ras突变体及AML1‑ETO融合基因慢病毒载体的构建设计K‑ras突变引物如下：K‑RasG12D正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，K‑RasG12D反向引物序列如SEQ ID NO:2所示，通过PCR扩增目的基因，回收、酶切、连接至慢病毒载体pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP，进一步完成克隆筛选，测序正确后重新培养含有阳性目的克隆的菌液，提取质粒保存备用；以Addgene公司购买的AML1‑ETO融合基因的质粒为模板，引物设计如下：AML1‑ETO正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，AML1‑ETO反向引物序列如SEQ ID NO:4所示，PCR产生AML1‑ETO基因，将扩增的目的基因亚克隆至pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP病毒载体；B、K‑ras突变体及AML1‑ETO融合基因慢病毒载体的包装接种细胞16‑20小时后，当细胞接近饱和时进行转染，将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为polybrene和2%FBS的细胞培养基。第一天，细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37℃培养过夜，感染时细胞长至30～50％的融合密度；第二天，当天转染时，将病毒液用含有8ug/ml polybrene和2%FBS的细胞培养液进行梯度稀释，然后小心吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100ul加入每孔细胞中，每个稀释度两个重复，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养；第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100ul的完全培养基；第五、六天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数；C、骨髓细胞分离及病毒感染情况监测断颈处死小鼠，游离出小鼠的两条下肢，剥离肌肉，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔，用无菌注射器轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管， 将细胞冲出，然后离心，去上清；离心沉淀下来的细胞用PBS冲洗，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养并接种于6孔板中，每孔加入K‑ras突变体与AML1‑ETO融合基因慢病毒的病毒悬液1～2ml，感染8h后离心收集细胞去上清，一部分种于96孔板中加入新鲜培养液继续培养24h，其它部分用于小鼠骨髓移植用，96孔板中的细胞在培养24～48h后用荧光显微镜观察并拍照；D、感染细胞植入小鼠建立白血病动物模型取8周的C57小鼠，先服用一周含有抗生素的水后进行8Gy辐照量的处理，辐照后部分小鼠尾静脉注射0.5～1×106小鼠骨髓细胞/只。