[发明专利]一种适合双向电泳的蚯蚓蛋白样品制备方法

摘要

本发明公开了一种适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品制备的方法。以蚯蚓为试材，于液氮中快速研磨，制得蚯蚓干粉。向蚯蚓干粉中加入以丙酮为溶剂的10%（w/v）的三氯乙酸，之后将-20℃下预冷的以丙酮为溶剂的10%（w/v）的三氯乙酸与所得沉淀充分混合，洗涤沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物。最后加入样品裂解液充分混合，离心取上清，制得适合双向电泳的高质量的蚯蚓总蛋白样品。本发明制备蚯蚓总蛋白双向电泳样品的方法可获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，为蚯蚓蛋白组学研究提供重要技术支撑。

主权项

一种制备蚯蚓总蛋白双向电泳样品的方法，其特征在于包括以下步骤：1）取吐泥1d后的蚯蚓于液氮中快速研磨成蚯蚓干粉，研磨时间为5‑15min；2）按蚯蚓干粉质量与以丙酮为溶剂的溶液A的体积之比为1：10的比例，向蚯蚓干粉中加入适量溶液A充分混合，‑20℃静置8‑12h，得到蚯蚓总蛋白样品；所述以丙酮为溶剂的溶液A中的溶质为：0.01‑0.03mmol/L的二硫苏糖醇、10%（w/v）的三氯乙酸；3）步骤2）中所得的蚯蚓总蛋白样品离心20‑30min：4℃，转速12000‑15000g，弃上清液；用‑20℃下预冷的以丙酮为溶剂的溶液A洗涤沉淀，‑20℃静置1‑2h，弃上清液；使用溶液A洗涤沉淀3次以上，直至上清液为无色透明为止,弃上清液，收集沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物；4）收集沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物；5）将步骤4）中得到的蚯蚓总蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液中振荡混合1‑2min后冰浴冷却1min,如此重复振荡混合1‑2h；裂解缓冲液包括9.8mol/L尿素（urea），4%(w/v)的3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS），65mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，2%(v/v)的胶条缓冲液(IPG buffer）,1%(w/v)的苯甲基磺酰氟（PMSF）；所述裂解缓冲液与蚯蚓总蛋白样品的质量体积比为0.04g/400μL‑0.05g/400μL；6）将步骤5）中混合液离心取上清液得到适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品。