[发明专利]茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进

摘要

本发明提供的茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进，使用合成的Rink_Amide_MBHA树脂作为标准样品，进行连续的重量递增称量，可以得到一组标准样品，经过茚三酮试剂反应，在OD570下读取吸光值，制得一条标准曲线，根据此标准曲线，可以对未知的肽树脂进行游离的氨基定量检测分析。

主权项

1.茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进，其特征在于：用与合成反应相同的Rink_Amide_MBHA树脂作为标准样品，制作标准曲线，对未知的样品进行残余氨基定量检测，其步骤如下：其1样品处理：称取Rink_Amide_MBHA树脂2g,计算树脂摩尔数A；用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔；将1A摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反应2小时，得到树脂肽；再经25%哌啶溶液26ml，处理30分钟，得到去除保护基后的树脂肽，备用；其中25%哌啶溶液的配制：25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀得；其中树脂摩尔数的计算公式：式中：A为Rink_Amide_MBHA树脂的摩尔数；m为Rink_Amide_MBHA树脂的克数；SD为Rink_Amide_MBHA树脂取代量值；其2检测步骤：1）将取去除保护基后的树脂肽15mg，使用无水甲醇溶液20ml对其清洗3次，经真空干燥机处置，其温度45℃，真空度93.3～98.6KPa；干燥结束，称取1.0mg，1.5mg，2.0mg，2.5mg，3.0mg；分别加入300ul Buffer A：和75ul BufferB，混和均匀，用100℃水浴加热15min，并置于15-20℃水中冷却至室温；取25ul的反应后的混合液加入到1.0ml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，在OD570下进行吸光值读取，并制作标准曲线；2）称取待测样2.0-3.0mg，加入Buffer A：300ul；Buffer B：75ul，混匀，100℃水浴加热15min，并用冷水冷却，取25ul的反应后的混合液加入到1.0ml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，在OD570下测定吸光值；其中Buffer A的配制：5ml吡啶+1.185g苯酚+5ml乙醇混匀；其中Buffer B的配制：500mg茚三酮+10ml乙醇；3）由于使用未合成的Rink Amide_MBHA树脂作为标准品，所以在计算时需要将由于缩合所增加的分子量减去，以保证计算结果的准确性；去除树脂肽增量的影响公式：式中X：去除增加的氨基酸分子量后的原始肽重量；W：树脂肽理论分子量；m：树脂肽实际称量重量；SD：Rink_Amide_MBHA树脂取代量值；其中4mer树脂肽的理论分子量为：541.73；Rink_Amide_MBHA树脂取代量值为：0.38mmol/g。