[发明专利]一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法

摘要

一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，本发明涉及建立鸡永生化前脂肪细胞的方法。本发明是要解决原代鸡前脂肪细胞不能无限传代、异质性、不同来源的细胞存在遗传背景差异等导致研究难以获得稳定可靠的结果的问题。一、克隆鸡端粒酶逆转录酶基因chTERT；二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR；三、构建逆转录病毒表达载体；四、包装制备逆转录病毒；五、永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1和永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2的获得。本发明应用于建立鸡永生化前脂肪细胞领域。

主权项

一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于建立鸡永生化前脂肪细胞的方法按以下步骤实现：一、克隆chTERT的全长编码区序列：首先利用RNA提取试剂盒提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA，采用反转录试剂盒将提取的鸡胚组织总RNA进行反转录得到鸡胚组织cDNA，分别设计三对扩增引物，以鸡胚组织cDNA为模板，分三段PCR扩增chTERT的全部编码区序列chTERT‑T1、chTERT‑T2和chTERT‑T3，将三段扩增产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒进行回收、纯化，设计PCR扩增引物P7并利用重叠延伸PCR的方法将chTERT‑T1和chTERT‑T2两个片段拼接起来，得到chTERT‑T1T2，将chTERT‑T1T2连接至pMD18‑T Simple载体，将chTERT‑T3连接至pMD18‑T载体，然后将两种连接产物分别转化TOP10感受态细胞，进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液分别扩培并提取质粒DNA得到pMD18TS‑T1T2与pMD18T‑T3，然后对pMD18TS‑T1T2质粒进行SalI‑NcoI双酶切鉴定，对pMD18T‑T3质粒进行SalI‑NcoI和SalI‑XhoI双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因的正确性，将测序正确的pMD18TS‑T1T2质粒和pMD18T‑T3质粒分别进行SalI‑NcoI双酶切，分别回收chTERT‑T1T2片段与pMD18T‑T3载体片段，将回收得到的chTERT‑T1T2片段与pMD18T‑T3载体片段连接，得到pMD18T‑chTERT；二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR：利用AA肉鸡基因组DNA为模板，以P8和P9为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行回收、纯化，获得chTR的基因序列，将chTR与TA克隆载体pMD18‑T进行连接，将连接产物转化TOP10感受态细胞，然后进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液进行扩培并提取质粒DNA得到pMD18T‑chTR，然后对pMD18T‑chTR质粒进行BglⅡ‑ClaⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因chTR的正确性；三、构建逆转录病毒表达载体：分别对pMD18T‑chTERT和病毒载体pLXRN进行SalI‑XhoI双酶切，分别回收chTERT和pLXRN的线性DNA片段并连接，构建了表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN‑chTERT，分别对pMD18T‑chTR和pLPCX进行BglⅡ‑ClaⅠ双酶切，分别回收chTR和pLPCX的线性DNA片段并连接，构建了表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX‑chTR，将构建好的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN‑chTERT和表达chTR基因的逆转 录病毒载体pLPCX‑chTR送交测序公司进行测序，再次验证目的基因克隆和载体构建的正确性；四、包装制备逆转录病毒：采用转染试剂将步骤三中制备的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN‑chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX‑chTR分别与被膜蛋白载体pVSV‑G共转染包装细胞GP2‑293，培养细胞，在24h、48h和72h收集细胞上清，过滤去除细胞碎片后加入病毒浓缩试剂，离心浓缩病毒，得到了分别表达chTERT基因的逆转录病毒和表达chTR基因的逆转录病毒，测定两种逆转录病毒的滴度，﹣80℃保存备用；五、逆转录病毒的感染和筛选：培养原代鸡前脂肪细胞，按照5×105cells/ml的细胞密度铺于培养皿中，用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400μg/mlG418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，对表达chTERT基因的阳性细胞换液培养6个月可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA‑1；或者先用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400μg/ml G418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，筛选结束后将表达chTERT基因的阳性细胞重新铺板，加入步骤四制备的表达chTR基因的逆转录病毒，感染48h后加入含有2.5μg/ml嘌呤霉素的选择培养基筛选表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞，对表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞传代培养2至3代，即可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA‑2；其中步骤一中PCR扩增chTERT‑T1片段所用上游引物P1为5’‑AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG‑3’，下游引物P2为5’‑GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG‑3’，步骤一中PCR扩增chTERT‑T2所用上游引物P3为5’‑TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC‑3’，下游引物P4为5’‑CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC‑3’，步骤一中PCR扩增chTERT‑T3所用上游引物P5为5’‑GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG‑3’，下游引物P6为5’‑CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG‑3’，步骤一中重叠延伸PCR扩增chTERT‑T1T2片段所用上游引物P7为5’‑GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC‑3’，下游引物为P4；其中步骤二中PCR扩增鸡端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8为5’‑ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC‑3’，下游引物P9为 5’‑CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC‑3’。