[发明专利]一种同时检测醋醅中四种功能微生物的多重PCR技术

摘要

本发明公开了一种用于检测醋醅中四种功能微生物的多重PCR技术，属于生物工程技术领域。该方法简便、经济、高效，在同一PCR反应管内能对多种微生物同时检测，是研究复杂微生物群落有效的技术手段之一。

主权项

一种用于醋醅中四种功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于多重PCR技术按照以下步骤进行：（1）醋醅微生物群落总基因组DNA的提取：称正常发酵过程的醋醅2‑5g，采用液氮研磨、溶菌酶和蛋白酶酶解、氯仿‑异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化步骤等提取总基因组DNA；（2）合成细菌16S rDNA V3区引物P1，P2，并以醋醅群落微生物总DNA为模板进行PCR扩增，得到细菌16S rDNA V3区的扩增片段；（3）利用变性凝胶梯度电泳(DGGE)对细菌16S rDNA V3区扩增片段进行分析，其电泳条件为：8%聚丙烯酰胺凝胶，100%变性剂浓度为7M尿素、40%甲酰胺，采用30%~50%变性梯度，上样量为200 ng，缓冲液为1×TAE，60℃，200V电压电泳3.5‑4 h，SYBRGreen Ⅰ染色，每15 min 染色一次，共染3次；（4）优势微生物的序列测定：选择DGGE凝胶上10‑20个最显著的条带，割胶回收进行序列分析，在NCBI中进行BLAST比对，初步确定优势微生物的种属；（5）功能微生物的筛选：以正常发酵的醋醅为筛选对象，采用肉汤、GYC、MRS 3种不同的培养基对不同功能微生物进行分离，选择生长较快、菌落形态不同、且GYC平板上有透明圈的60‑80个菌落，纯化后保存；（6）功能微生物的确定：对上述获得的纯培养微生物进行酶切分型，将分型结果不同的菌株进行16S rDNA 测序，测序结果与DGGE获得的优势微生物进行比较，选择4株优势微生物用于多重PCR技术；（7）针对上述4株功能微生物菌株设计特异性引物，其中功能微生物菌株包括一株芽孢杆菌、一株醋酸菌和两株乳酸菌；（8）对4株功能微生物的多重PCR条件进行组合优化：包括反应体系的确定，反应条件的优化，最终使得4种微生物在同一PCR条件下同时被检测出来；（9）利用上述确定的多重PCR条件，对发酵过程中醋醅样品中的功能微生物进行快速检测。