[发明专利]多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法

摘要

本发明公开了一种从成体多器官中分离纯化NG2阳性干细胞群的有效方法，先从成体中枢神经系统、眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏组织中消化分离获得悬浮单个细胞群，再通过30%和70%percoll分离液离心分离获得NG2阳性干细胞群并进行原代培养，所得多器官源性成体NG2阳性干细胞群纯度高，增殖能力强，具有相似的发育学特性和干细胞潜能，对损伤信号反应及时、强烈，在相应器官损伤微环境下能够迅速分化为功能性修复细胞，有望作为新型干细胞群对损伤器官实施有效治疗；本发明不仅为今后深入研究多器官中NG2阳性细胞群的生物学特性及其在再生医学中的作用奠定了基础，而且为干细胞临床治疗和再生医学领域提供了新型干细胞群。

主权项

多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：a．分离成年哺乳类动物的眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏组织，去除被膜，用含有抗生素的MEM培养液充分冲洗并破碎组织；所述哺乳类动物为小鼠；b．向步骤a破碎后的组织中加入细胞消化液，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育30分钟，再加入含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液，充分吹打分散细胞，用孔径为70µm的细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，2000rpm离心5分钟，弃上清；c．向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30% Percoll分离液，混匀，再将混合物加至与30% Percoll分离液等体积的70% Percoll分离液的液面上，2000rpm离心30分钟，收集位于两种Percoll分离液界面的细胞层，用含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液洗涤并重悬，制成细胞悬液；d．将步骤c所得细胞悬液接种至预先用0.1mg/mL 多聚赖氨酸溶液过夜包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，每隔7天补加新鲜培养液1次，待NG2阳性干细胞初次出现时全量更换新鲜培养液，之后每隔4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群；所述新鲜培养液为新制的含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液；e．将步骤e所得原代NG2阳性干细胞群用细胞消化液消化后进行传代培养；步骤a中所述含有抗生素的MEM培养液是含有100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的MEM培养液；步骤b和e中所述细胞消化液是胰酶/EDTA消化液，由质量分数为0.25%的胰酶溶液与质量分数为 0.02%的EDTA溶液按体积比为1: 1混合而成；步骤b中所述含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为0.04%的脱氧核糖核酸酶I、质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的DMEM/F12培养液；步骤c和d中所述含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL 青霉素和100µg/mL链霉素的DMEM/F12培养液。