[发明专利]中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法

摘要

本发明公开了了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法，其步骤为中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达载体的构建和中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达；本发明成功表达了MIH蛋白，为进一步了解早熟蟹性腺提早发育的内在机理，了解蟹类蜕皮腺的功能机制并为进一步制定控制河蟹性早熟的技术措施提供理论基础，获得实现生长发育和繁殖的人工调控的基础。

主权项

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法，其步骤包括为：步骤一：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达载体的构建：(1)引物的设计，根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的成熟肽编码区cDNA序列和质粒pPIC9的多克隆位点设计一对PCR引物，其中上游引物包含1个Xho I、l个KEX2蛋白酶识别位点和MIH基因的前15个核苷酸序列，箭头位置为酵母α因子信号肽的切割位点，下游引物包含MIH基因编码区的最后15个核苷酸序列、1个6‑His编码区段、1个Not I识别位点及一个翻译终止密码子；(2)PCR反应；(3)TA克隆；(4)质粒提取；(5)酶切连接转化；(6)阳性克隆的鉴定，用PIC‑MIH‑L和PIC‑MIH‑R进行菌落PCR筛选阳性克隆；(7)重组质粒的鉴定，PCR产物电泳出现阳性条带的克隆按照1：100的比例稀释扩增，抽提质粒，按照引物设计的酶切位点做Xho I和Not I双酶切鉴定；挑选双酶切能出现阳性条带的克隆，并送测序验证，阳性菌落置于‑20℃保种备用；步骤二：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达：(1)贮存液的配制；(2)培养基的配制；(3)菌种的复苏，把已经鉴定为含阳性克隆重组质粒pPIC9‑MIH1的保种克隆菌JM109及空载体pPIC9的保种菌株DH5α按照1：100转入新的含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养液中37℃恒温，22orpm摇床过夜；(4)质粒的提取，把过夜培养的菌液1000g离心5min收集细胞，用mini BESTPlasmid Purification kit试剂盒抽提重组质粒pPIC9‑MIH1和pPIC9，‑20℃保存备用，取2μl质粒用1%琼脂糖凝胶电泳检测；(5)重组质粒pPIC9‑MIH1和pPIC9的线性化，用限制性内切酶BglI分别对质粒pPIC9‑MIH1和pPIC9进行单酶切反应，使其线性化，酶切反应体系为： 10×Buffer D 10μl，BglII 1μl，质粒40μl，补双蒸水至100μl，37℃水浴反应2小时，酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，同时用未酶切的质粒pPIC9‑MIH1和pPIC9做对照，将已经线性化的pPIC9‑MIH1和pPIC9用1%的琼脂糖凝胶电泳后，分别用凝胶回收试剂盒回收纯化；(6)酵母感受态细胞的制备；(7)MIH1基因的电转化；(8)酵母转化菌的鉴定；(9)MIH1表达阳性克隆的筛选；(10)最佳诱导时间的确定，取BMGY/BMMY培养基诱导的一株重组酵母菌不同时段所取的诱导菌液1.5ml，4℃,12000rpm离心10min，上清液用0.75g硫酸铵沉淀，去上清液后，将沉淀与30μl SDS样品缓冲液混合，100℃煮沸5min，各取20μl上样，Tricine‑SDS‑PAGE凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色显带后，用凝胶成像系统分析，以确定最佳诱导时间；(11)筛选菌株的SDS‑PAGE检测；(12)重组MIH1的大规模诱导表达，步骤包括接种GS115/pPIC9‑MIH1表达阳性克隆菌于10ml BMGY培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养36hr后，至OD600>3.0；按1%接种于1000ml BMGY培养基中，30℃，250rpm摇床振荡培养36hr后，无菌条件下5000rpm离心10min，弃上清；在菌体沉淀中加入200ml BMMY培养基，振荡混匀，继续30℃，250rpm摇床振荡培养培养；每隔24hr，取诱导菌液1.5ml，4℃，12000rpm离心10min保存上清液于‑20℃待用，然后添加甲醇至终浓度为0.5%，共诱导4天；诱导结束时，分别取各菌株的诱导菌液1.5ml，4℃，12000rpm离心10min保存上清液于‑20℃以备聚丙烯酰胺凝胶电泳；分析和蛋白印迹分析，将菌液4℃，8500rpm，离心10min，收集上清液。