[发明专利]一种海参体表细菌DNA提取方法

摘要

本发明公开一种海参体表细菌DNA提取方法，其通过对样品进行超低温冷冻以降低样品粘度，以利于样品中的细菌分散到具有缓冲、降低粘度的洗脱液Ⅰ中；再在菌体收集步骤中，通过多次低速离心除去样品中糊状的多糖和蛋白；粘多糖和杂蛋白的脱除步骤中，裂解液中添加了CTAB溶液以去除粘多糖，添加蛋白酶K以进一步去除可溶性杂蛋白的干扰；最终通过洗脱液Ⅱ抽提的方法，获得细菌DNA。本发明采用常用的试验试剂，无需特殊的实验条件，操作简单，重复性好，细菌DNA提取质量高。该方法适用于从富含多糖、蛋白样品中提取细菌DNA，具有广泛的应用范围、应用前景。

主权项

一种海参体表细菌DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤，（1）海参样品处理：取鲜活海参用无菌生理盐水冲洗三次，无菌封装后，迅速放置‑80℃保存24h，取出海参在无菌条件下，用无菌刀片刨刮海参体表，将刨刮物放于无菌离心管中，50mL离心管装湿重6~10g的海参体表刨刮物；（2）海参体表菌体收集：①向步骤（1）获得的离心管中，加入15~20mL洗脱液Ⅰ，常温下300rpm震荡5~10min，使刨刮下的海参体表粘稠物与洗脱液Ⅰ充分混合；②4℃下1000rpm离心5~8min，去除下层海参组织沉淀物及上层糊状物，将剩余液体转移到另一无菌离心管中；③重复步骤②直至完全去除沉淀物和糊状物；④将步骤③所得液体分装于1.5mL离心管，并于4℃10000rpm离心1~2min，收集沉淀，即为海参体表菌体沉淀物；（3）粘多糖和杂蛋白的脱除：于步骤④所得海参体表菌体沉淀物中，加入500uL裂解液，吹打至沉淀悬浮，然后55℃孵育震荡1~3h，直到悬浮液澄清，简短离心以去除管盖内壁水珠；（4）细菌破壁上述液体中加入180uL的浓度为20mg/mL溶菌酶，于37℃孵育酶解至少30min，期间间隔震荡直到产生的白色沉淀消失，简短离心以去除管盖内壁水珠；（5）抽提、纯化：⑤向步骤（4）获得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脱液Ⅱ，充分混匀后4℃12000rpm离心10~15min；⑥吸取步骤⑤中上清液500uL，加入洗脱液Ⅱ500uL于1.5mLEppendorf管中，混匀后4℃12000rpm离心10min；⑦吸取步骤⑥中上清液400uL，加入于‑20℃预冷的无水乙醇，800uL于1.5mL Eppendorf管中，混匀后‑20℃静置20min，4℃下12000rpm离心10min；⑧白色沉淀用70%的乙醇洗涤2~3次，晾干后溶于100uL无菌超纯水中，轻轻震荡直至沉淀溶解，或放置于50uL缓冲液TE中，于‑20℃条件下贮存。