[发明专利]一种评价防治骨质疏松药物作用的新方法

摘要

本发明公开了一种模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，该方法通过选用斑马鱼作为模型动物，通过优化的实验分组方法进行实验分组设计，采用优选的药物给药方式进行给药，采用优选的方法对斑马鱼骨骼进行茜素红染色，采用直观的显微观察捕捉图像，并采用优选的图像分析软件分析骨骼染色区域以反应骨矿化量，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物在斑马鱼体内对骨量生成的影响，能快速、准确评价化合物及复杂中药成分防治骨质疏松的作用。能克服一般体外细胞实验难条件苛刻，难以体现在体效应综合结果的缺点，并克服哺乳动物体内实验耗时长，受试药量大、劳动强度高等缺点。该方法实验结果准确度高，且实验方法可重复性强，所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。

主权项

一种用于评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，利用茜素红可特异性地与钙离子螯合从而使矿化的骨基质染成红色的特性，其特征在于运用模式生物斑马鱼为评价模型，在给予斑马鱼幼鱼防治骨质疏松药物后，通过对其骨骼进行茜素红染色后的图像进行采集和分析，计算出染色区域的面积和累积光密度，即反映骨矿化量和骨密度的数据，以此作为对药物作用效果的评价指标；具体包括以下步骤：步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14‑12小时：10‑12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26°C‑30°C恒温培养箱中培养；步骤二：给药方案：取受精后3天斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基0.1‑2mL，每个孔里放1‑10条幼鱼，分为数组，每组5‑15条鱼，溶媒阴性对照组和测试药物组，从受精后4天或受精后5天开始加入溶媒和测试药物，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26°C‑30°C恒温培养箱中培养，培养周期5‑7天，每天将每个孔里的溶液吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后9‑11天或者10‑12天；步骤三：斑马鱼骨骼茜素红染色：将培养至斑马鱼胚胎受精后9‑11天或者10‑12天的幼鱼用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐处死，然后将幼鱼固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中2‑3h，将固定液4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液去除，然后将斑马鱼幼鱼置于50%乙醇中10min，去除乙醇，加入用0.5%KOH配制的茜素红染色液，放置过夜，去除染色液，加入超纯水洗去多余的染液后加入新鲜配制的漂白剂，放置20min‑2h，去除漂白剂后，加入3:1的0.5%KOH和甘油的混合溶液30min‑8h，然后更换溶液为1:1的0.5%KOH和甘油的混合溶液6h‑24h，最后更换溶液为1:3的0.5%KOH和甘油的混合溶液6h‑24h，最后保存于纯甘油中；步骤四：斑马鱼骨骼染色的检测与分析：用倒置显微镜观察步骤三中茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置，用专业图像 分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行t‑检验。