[发明专利]用于卷烟辅助材料安全性评价及其筛选的生物热化学方法

摘要

本发明公开一种用于卷烟辅助材料安全性评价及其筛选的生物热化学方法。本方法采取体外宏观微量热实验，通过等温热活性检测仪对已经过处理的微观研究对象整个代谢过程进行实时监测，利用采集模块收集过程中的热量变化，计算出相关物理化学参数。本发明操作简单、成本极低、实验周期短、效率高、结果准确可靠，还能实时观测整个代谢过程，开创了一种初步鉴定卷烟减害效果以及添加物筛选的新方法，为后面的进一步分析评价提供了重要的参考依据，并且在提高了效率的同时大大降低了成本。

主权项

一种卷烟辅助材料的安全性评价及筛选的生物热化学方法，包括以下步骤：⑴大肠杆菌：LB培养基用于培养及测试，LB培养基配方为5g酵母粉，10 g蛋白胨，5gNaCl溶于1L二次蒸馏水中，调节pH至7.4，在120℃、1.034×105Pa高压灭菌处理20min，待用；⑵金黄色葡萄球菌：LB培养基用于培养及测试；⑶白色假丝酵母菌：LB培养基用于培养及测试；⑷热带假丝酵母菌：LB培养基用于培养及测试；⑸酿酒酵母菌：YPDA培养基用于培养及测试，YPDA培养基配方为20g蛋白胨、10g酵母抽提物、2g葡萄糖用适量二次蒸馏水溶解，再加入15ml的0.2%腺嘌呤溶液，定容到1 L，120℃高压灭菌15min，室温贮存，待用；⑹枯草芽孢杆菌：LB培养基用于培养及测试；⑺苏云金芽胞杆菌：LB培养基用于培养及测试；⑻植物乳杆菌：乳酸菌培养基用于其培养和测试，培养基配方为将7.5g酵母粉、7.5g蛋白胨、10g葡萄糖、2gKH2PO4、0.5ml吐温80溶于900ml二次蒸馏水，再加入100ml番茄汁，混匀后低温贮存，待用；⑼嗜盐古生菌：嗜盐古生菌培养基用于培养及测试，嗜盐古生菌培养基配方为：250gNaCl，2gK2SO4，30gMgCl2·6H2O，2g酵母提取物，2.5g水解乳蛋白，溶于1L二次蒸馏水中，待用；⑽四膜虫：四膜虫培养基用于培养及测试，四膜虫培养基配方为15g蛋白胨、5g酵母粉、1g葡萄糖溶解于1L蒸馏水中，pH值调至7.0~7.5，高压灭菌后待用；⑾成纤维细胞：成纤维细胞培养基用于培养及测试，成纤维细胞培养基配方为MEM基础培养基，加入10%胎牛血清和0~0.4g·L‑1的非必需氨基酸；MEM培养基基本成分为0.20g·L‑1无水CaCl2、0.0977g·L‑1无水MgSO4、0.40g·L‑1 KCl、6.8g·L‑1 NaCl、0.122g·L‑1 NaH2PO4、0~0.001g·L‑1酒石酸胆碱、0~0.001g·L‑1叶酸、0~0.002g·L‑1肌醇、0~0.001g·L‑1烟酰胺、0~0.001g·L‑1D‑泛酸钙、0~0.001g·L‑1盐酸吡哆辛、0~0.0001g·L‑1核黄素、0~0.001g·L‑1盐酸硫胺、1g·L‑1葡萄糖、0~0.001g·L‑1丁二酸、0~0.001g·L‑1丁二酸钠、0.011g·L‑1芬红、0~0.0001g·L‑1卡那霉素以及0.1~0.3 g·L‑1必需氨基酸；⑿上皮细胞：上皮细胞培养基用于培养及测试，上皮细胞培养基配方为MEM基础培养基，加入10%胎牛血清和0~1%的非必需氨基酸；⒀线粒体：线粒体提取液配方为0.22mol·L‑1甘露醇，0.07mol·L‑1M蔗糖，0.02mol·L‑1羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES，0.002mol·L‑1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris‑HCl，0.001mol·L‑1乙二胺四乙酸二钠盐EDTA.2Na，pH为7.0~7.4；线粒体测试液配方为0.22mol·L‑1甘露醇，0.07mol·L‑1蔗糖，0.01mol·L‑1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris‑HCl，0.001mol·L ‑1乙二胺四乙酸二钠盐EDTA.2Na，pH为7.0~7.4；2）卷烟烟气凝聚物收集预处理：按标准吸烟机操作方法；将烟气捕集后，以水、质量分数为5~50%乙醇溶液或者质量分数为10~50%N,N‑二甲基甲酰胺溶液为萃取液，进行振荡或超声波萃取10~60min，过滤后待用；3）将步骤1）中的每10~500ul的模式研究对象菌液加入5 ml对应的液体培养基中；4）将步骤2）的浓溶液或悬浊液分成0μl、5μl、10μl、20μl、50μl、100μl、200μl浓度梯度，并将不同浓度梯度的浓溶液或悬浊液加入步骤3）中液体培养基中，振荡均匀后，5）将步骤4）中振荡均匀的液体培养基放置于量热仪TAM air或TAM3中，设定温度为20~40℃恒温，6）待温度达到设定值且稳定后，将培养液导入微量热仪的检测室，开始采集数据；7）根据采集数据进行作图、拟合和计算，获得相关的生长产热曲线及热动力学参数，其参数包括代谢过程的生长速率常数k、最大产热功率Pm、总放热量Q、传代时间tG、最大热功率对应的时间tm、出峰时间tp和抑制率I、半抑制浓度IC50；8）比较相关的生长产热曲线及热动力学参数相关的生长产热曲线及热动力学参数，分析加入不同材料对模式研究对象正常代谢的影响及其差异，获得有关卷烟辅助材料安全性的初步评估，可对众多的辅助材料进行筛选；分析有无加入新型材料的烟支，其烟气对模式研究对象代谢指标的影响差异性，可评价卷烟辅助材料是否具有显著的 降焦减害的效果。