[发明专利]一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用，所述枯草芽孢杆菌J18菌种编号为CGMCC No.3665，菌种名称：枯草芽孢杆菌（Bacillus substilis）J18，所述蛋白制品的制备方法为将J18抗菌蛋白与1%的用醋酸调至pH6.0的壳聚糖溶液复配成浓度为0.05mg/mL的被膜剂，用于浸果，也可将J18抗菌蛋白溶液与氧化淀粉溶液混合后涂于保鲜纸，制成抗菌保鲜纸用于包果，本发明它对果实和农作物病害有显著的防治效果，尤其对梨采后黑斑病的防治有显著效果，是一株广谱高效的拮抗菌株。

主权项

一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白的制备方法，所述枯草芽孢杆菌J18菌种编号为CGMCC No.3665，菌种名称：枯草芽孢杆菌（Bacillussubstilis）J18，其特征是它包括以下步骤； J18抗菌蛋白的制备； 种子活化：将枯草芽孢杆菌J18菌株从保存的甘油菌转接于LB液体培养基中，于30℃、150‑250rpm培养18h，得J18菌悬液；取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到LB固体平板培养基中，于25℃培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于LB液体培养基试管中，于30℃、150‑250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL LB液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30℃振荡培养，转速为150‑250rpm；得活化的菌悬液； 种子培养:将活化的菌悬液接种到LB液体培养基中，150‑250r/min，30℃摇床培养16h； 发酵培养:使用30L发酵罐进行分批发酵；装料系数0.6(18L)，接种量5%，发酵温度30℃，通气量0.5m3/h，搅拌转速150‑250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，pH 6.8~7.2，不流加调节pH值的酸碱性物质； 发酵培养基配方为淀粉3g、蔗糖5g、硫酸锰30.8mg/kg的溶液2mL、磷酸氢二钾3g、磷酸二氢钾1.5g、豆粕30g，水1000mL； 发酵周期:34±2h； 取菌株J18发酵上清液经0.22μm孔径的细菌过滤器过滤制成无菌滤液；取无菌滤液，采用(NH4)2SO4沉淀法提取，在硫酸铵梯度40‑70%下，4℃下沉淀过夜，8,000r/min离心20min，沉淀用0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)悬浮，SepherdexG‑25层析除盐，真空冷冻干燥，获得J18抗菌蛋白； 所述LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和水1000mL； 所述LB固体平板培养基的组分为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g和水1000mL。