[发明专利]一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法

摘要

本发明公开了一种通用的CaMV（花椰菜花叶病毒）35S启动子定量检测方法，涉及分子生物学及转基因检测技术领域。本定量检测方法是：①收集CaMV35S启动子增强子保守区序列；②利用该序列特征设计引物探针；③PCR扩增；④建立标准曲线；⑤定量体系的精确性验证。本发明避免了现有一些CaMV35S启动子检测方法存在的检测引物/探针与检测靶标序列不完全匹配的问题；避免了现有一些CaMV35S启动子检测方法存在的两侧引物结合位点数不同而引起的多条扩增产物的问题；适用于含有CaMV35S启动子的转基因油菜、水稻、大豆等转基因作物的定量检测。

主权项

一种通用CaMV 35S启动子定量检测方法，其特征在于：①收集CaMV 35S启动子增强子保守区序列：收集GMDD（GMO Detection Method Database，转基因检测方法数据库，http://gmdd.shgmo.org/）所公布的不同转化事件来源的CaMV 35S启动子序列，通过其序列比对结果，以其增强子序列的保守区为检测靶标，其序列特征是：由来源于野生型CaMV 35S启动子第7018至7344个碱基组成，如图1所示：②利用该序列特征设计引物探针：a、合成引物序列如下：35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’和35SEnhR311：5’TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’；b、合成TaqMan探针序列如下：35SEnhFP230：5’FAM－CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG－BHQ13’；③PCR扩增：提取样品总DNA，分别利用上述引物35SEnhF187/35SEnhR311和探针35SEnhFP230组合进行荧光定量PCR扩增；④建立标准曲线：以含有CaMV 35S启动子的转基因油菜OXY235基因组DNA为研究模型，利用相同浓度非转基因油菜基因组DNA稀释至不同含量，以100ng的混和油菜基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线；⑤定量体系的精确性验证：以标准曲线为参照测定含有OXY235基因组DNA的混和油菜基因组DNA样品中CaMV 35S启动子的量。