[发明专利]海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法与用途

摘要

本发明是一种海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法，该方法以禾谷镰刀菌为指示菌，利用硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析、高效液相色谱（HPLC）等方法对多粘类芽孢杆菌L1-9菌株产生的抗菌活性组分进行了分离纯化，得到了1个抗真菌化合物B2，通过ESI-MS、1HNMR、13CNMR等波谱技术对其进行结构鉴定，确定B2为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）。本发明方法从多粘类芽孢杆菌代谢产物中分离得到邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，并且实验证明DEHP对禾谷镰刀菌具有明显的抑制作用。细菌具有生长周期短、易于在实验室大量培养、发酵产物物质更易提纯等优点，利于大规模发酵实现工业化生产。

主权项

一种海洋多粘类芽孢杆菌L1‑9发酵产物提取DEHP的方法，其特征在于，其步骤如下：（1） L1‑9菌株发酵液的制备：用发酵罐对L1‑9菌株进行分批发酵，发酵条件为：种子液的菌龄24h、浓度为109个细胞/mL，接种量8%，温度28℃，pH 6.3，初始搅拌速度250r/min，通气量3L/min，发酵时间36h；得L1‑9菌株发酵液；L1‑9菌株发酵液经10000r/min离心后，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的L1‑9菌株发酵液进行初步提取；（2）抗菌活性物质的初步提取：L1‑9菌株发酵液用等体积乙酸乙酯萃取2次，静置12h后，合并有机相，减压浓缩后得到红褐色油状粗提物，以50μl/孔粗提物对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的粗提物进行分离纯化；（3）抗菌活性物质的分离纯化：a. 硅胶柱层析：粗提物采用2.5×60cm硅胶柱进行初步分离，装柱体积为200mL，湿法上样，以体积比为100~80：0~20的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，每种比例洗脱液体积400mL，流速0.5mL/min，每管收集10mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液进行Sephadex LH‑20柱层析；b．Sephadex LH‑20柱层析：洗脱液用1.5×50cm的Sephadex LH‑20柱进行层析分离，湿法上样，以体积比为3:2的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL/h，每管收集2‑3mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，采用体积比为5：1的石油醚‑乙酸乙酯溶液或者98：2的二氯甲烷‑甲醇溶液作展开剂，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液经TLC检测有3个斑点，3个斑点迁移率分别为0.47、0.66、0.91，再采用制备薄层层析进一步分离纯化；c.制备薄层层析：采用体积比为5：1的石油醚‑乙酸乙酯溶液或者98：2的二氯甲烷‑甲醇溶液作展开剂，得到迁移率分别为0.47、0.66、0.91的3个组分B1、B2、B3，3个组分分别以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，B1、B2的抑菌带宽度均大于5mm；（4）高效液相色谱法检测纯度：分别取适量B1、B2溶于甲醇后，经0.22µm一次性针头过滤器过滤，利用分析型HPLC，以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，色谱条件为：以柱规格为6mm×250mm的YMC‑Pack ODS‑A分析柱，波长为254nm 的UV 检测器进行检测，进样量为20µL，以1 mL/min 的流速洗脱40 min，B1、B2的质量含量达95%以上后进行结构鉴定；（5）结构鉴定：采用质谱和核磁共振方法对B1、B2分别进行结构鉴定，确定B2为邻苯二甲酸二(2‑乙基己基)酯，即DEHP。