[发明专利]三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法

摘要

本发明公开了一种三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法，按如下步骤进行：选择DMEM/F12培养基，并加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、表皮生长因子和硫酸软骨素制备细胞培养液；在工作台上取三倍体泥鳅的鳍并用碘伏、双抗等漂洗处理，在细胞培养瓶中进行原代培养；待细胞长成单层后制成细胞悬液并加入培养基进行传代培养。步骤简单，易操作；所培养的三倍体泥鳅鳍细胞的形态为纤维样，可以连续传代并直接应用于多倍体鱼类生物学研究、病毒分离扩增、疫苗研制及功能基因研究。

主权项

一种三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法，其特征在于按如下步骤进行：a．制备细胞培养液取DMEM/F12培养基，向培养基内分别加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、表皮细胞生长因子和硫酸软骨素制备细胞培养液，其中胎牛血清占总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子浓度为20ng/ml、表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml、硫酸软骨素的浓度为10ug/ml；在4℃的环境下存放；b. 原代培养在工作台上取三倍体泥鳅的鳍组织，用质量浓度为10%的碘伏浸泡15分钟；再用青霉素和链霉素的混合液浸泡30分钟，青霉素浓度为500IU/ml，链霉素的浓度为500ug/ml；再用PBS漂洗后，于5%FBS‑DMEM/F12（pH7.2）中剪成0.8~1.2mm3的块状；经上述处理的鳍组织块均匀接种于25cm2细胞培养瓶中，在25℃CO2培养箱中正置干贴24h后补加培养液至5ml/瓶，启动原代培养至细胞长成单层；c. 传代培养吸出培养瓶中的培养液，加入0.25%的胰蛋白酶溶液1ml，5秒钟后吸去胰蛋白酶溶液，使得瓶底形成一层胰蛋白酶膜，消化5min，轻磕细胞培养瓶；将之前吸出的培养液加回，用吸管吹打，制成细胞悬液；将细胞悬液以体积比1:1分到两个新的培养瓶中；向两个培养瓶中补加a步骤所得培养液至5ml；在25℃CO2培养箱中培养至细胞长成单层。