[发明专利]一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法

摘要

一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法，属于天然食品和药物提取技术领域。包括缓冲液萃取、硫酸铵盐析、柱层析等步骤，本发明提取率可达到约10mg/100g（纯酶/原料），纯度可达95%以上，提取所得的酶的最大反应速度约为3.5×105(U/min•g酶)，解决了莲蓬副产物的利用问题，能提高莲产物的经济附加值。

主权项

一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法，其特征是按如下步骤：（1）提取缓冲溶液的制备：在0.1~1.0mol/L pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液中加入Triton X‑100、聚乙二醇和NaCl等破壁剂制得提取缓冲溶液，使该提取缓冲溶液含Triton X‑100 0~5 g/100mL、聚乙二醇0~5 g/100mL、NaCl 0.1~2.0 g/100mL，2℃~5℃冷却处理； (2)取新鲜的或冷冻保藏去籽莲蓬，撕碎或切片，按照1:1~1:5的料液比（g/ml）加入步骤（1）中的提取缓冲溶液，冰浴或冷冻等低温环境下匀浆后，超声波处理10~20min，浆体在4℃~常温下静置20~60min，静置过程中搅拌3~5次，过滤浆体，取清液；所得的清液在4℃~20℃条件下低温离心10~20min，离心速率为4000g，弃去沉淀，保留上清液，往上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体粉末使其达到30~40%的饱和度，4℃~20℃低温条件下离心20~40min，离心速率为8000~13000g，弃去沉淀物，保留上清液；继续往上清液中加入固体(NH4)2SO4固体粉末以达到70~80%的饱和度，4℃~20℃条件下离心30~60min，离心速率为10000~15000g，弃去上清液，保留沉淀物；沉淀物用少量的0.1~1.0mol/L pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提物；(3)将步骤（2）的粗提物分装于经过常规预处理的截留分子量10~25kDa的透析袋，以水或者0.1~0.3mol/L pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液作为透析液，4℃条件下透析5~20h除盐；通过截留分子量10~25kDa的超滤至合适的体积，即得到多酚氧化酶的粗提物； (4)将步骤（3）的多酚氧化酶粗提物按照上样体积：柱床体积=1:10~1:50的比例，经过离子交换树脂柱，分别用水和0.2~1.0mol/L的梯度NaCl溶液洗脱；以儿茶素为底物测定多酚氧化酶的酶活力，收集酶活最高的占体积总量20‑30%的洗脱液；再经凝胶柱用相同方法的洗脱和收集，得到酶活最高的占体积总量20‑30%的洗脱液；用步骤（3）中方法透析处理，经过超滤或冷冻干燥得到纯化的多酚氧化酶。