[发明专利]人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法

摘要

本发明公开了一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法：在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养人胚胎干细胞，分选状态良好的人胚胎干细胞克隆团，接种于经丝裂霉素C处理过的人角膜基质成纤维细胞层上，培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞，加入培养瓶内，采用人角膜内皮细胞条件培养基置于37℃、5%CO2孵箱内孵育培养，隔天换液，培养10天左右，即得角膜内皮细胞，其增殖能力类似正常人角膜内皮细胞,体外最多能传1～2代，可以作为种子细胞用于组织工程角膜构建及移植。

主权项

一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于：步骤如下：（1）人角膜基质成纤维细胞的原代培养：将新鲜人角膜环浸于含100U/ml青霉素‑100U/ml链霉素的平衡盐溶液冲洗消毒，置于倒置显微镜下，上皮刀刮除角膜上皮，显微镊子撕除后弹力层及内皮，剩余角膜基质用显微剪剪成1mm×1mm组织块，均匀贴壁于培养皿，待贴壁牢固后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO2孵箱内孵育培养，每3天更换一次培养基；待细胞铺满培养皿底部70%～80%时1：2传代培养；传代培养至第四代，加入上述培养基及丝裂霉素C，抑制2小时，获得人角膜基质成纤维细胞层；（2）常规原代培养小鼠胚胎成纤维细胞，取其3～4代作为饲养层，采用人胚胎干细胞培养基常规培养人胚胎干细胞，机械法分选形态状态良好的人胚胎干细胞克隆团，按照8～12个克隆/cm2密度接种于步骤（1）制备的人角膜基质成纤维细胞层上，采用不含bFGF的人胚胎干细胞培养基培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，机械法将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至10ug/ml纤维连接蛋白包被的培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞；（3）人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞：将步骤（2）分选出的人神经嵴干细胞用人角膜内皮细胞条件培养基重悬，加入经10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，置于37℃、5%CO2孵箱孵育培养，隔天更换人角膜内皮细胞条件培养基，培养至细胞基本长满，互相间形成紧密连接呈多边形单层排列，即得人角膜内皮细胞。