[发明专利]一种融合蛋白的纯化和复性方法

摘要

本发明提供一种融合蛋白的纯化和复性方法，包括以下几个步骤：蛋白质的纯化、样品稀释、膜包准备、浓缩和置换步骤。本发明的有益效果是：本方法可工业化放大、纯化后得到的纯度是在蛋白得率高的情况下，纯度也高，并且还具有稳定的抗原活性。

主权项

1.一种融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，包括以下几个步骤：蛋白质的纯化、样品稀释、膜包准备、浓缩和置换步骤；所述蛋白质的纯化步骤包括：将包涵体变性液上样到含Q‑Sepharose F.F 柱子，用平衡缓冲液A 清洗后，用洗脱缓冲液B 洗脱目标峰，再将来自Q‑Sepharose F.F 柱子上的洗脱峰上样到事先用平衡缓冲液C 平衡好的含有陶瓷基质羟基磷灰石的柱子，收集含有Mtb72f 的穿透峰；其中，所述平衡缓冲液A 为：50mM NaCl,20mM Bis‑Tris,6M 尿素，pH=7.0 ；缓冲液B 为：90 mM NaCl,20mM Bis‑Tris,6M 尿素，pH=7.0 ；平衡缓冲液C 为：250mM NaCl,20mM Bis‑Tris,6M 尿素，pH=7.0；所述浓缩和置换步骤包括：1）将稀释后的穿透峰浓缩至1.1‑1.6g/L, 循环流速为6L/min/ M²，每分钟的渗析流速控制在浓缩后料液体积的1/18，将样品超滤浓缩至浓度为3.0‑3.8g/L ；2）将步骤1 所得到的样品用Tris 缓冲液进行透析置换，透析过程中，循环速度保持在6L/min/ M²，渗析速度与步骤1 浓缩时一致，加缓冲液的速度与渗析速度相同；3）将步骤2 所得到的样品浓缩至步骤1 的浓缩体积的0.38‑0.40 倍，循环速度和渗析速度与步骤1 相同；4）以步骤3 中用Tris 缓冲液透析处理，透析过程中，循环速度保持在6L/min/ M²，循环速度和渗析速度与步骤1 相同，加缓冲液速度与渗析液的速度相同；5）收集步骤4 的浓缩液，再将所述膜包用一定量的20mM、pH=7.5 的Tris 缓冲液清洗，共清洗3 次，收集滤出液，加入浓缩液混合检测蛋白浓度后，添加20mM、pH=7.5 的Tris 缓冲液，使样品蛋白终浓度为2.0mg/mL；所述样品稀释步骤包括：用紫外分光光度计测定穿透峰的浓度，用洗脱缓冲液B 稀释至 0.20‑0.30g/L；所述膜包准备步骤包括：用NaOH 溶液循环清洗Centramate 膜包，再用Na₂HPO₄ 清洗2 次，再用平衡缓冲液C清洗至渗出液pH 值为7.0±0.10；所述步骤2 中Tris缓冲液的用量为：以步骤1 浓缩后的体积的2.5 倍体积，且浓度为20mM 的Tris 缓冲液进行透析置换；所述步骤4 中的用量为以步骤3 浓缩后的体积9.5 倍体积、pH=7.5、浓度为20mM 的Tris 缓冲液透析处理。