[发明专利]人羊膜间充质干细胞的分离方法

摘要

本发明提供一种酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的过程中的hAMSCs的分离方法，所述培养过程包括如下步骤：hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测。本发明采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，通过加入4ng/mlEGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)。本发明的酶消化法联合联合EGF具有操作简单，快速实用等优点，是一种较为有效的分离纯化hAMSCs的方法。

主权项

一种人羊膜间充质干细胞的分离方法，其应用于酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的过程，所述培养过程包括如下步骤：hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测；其特征在于，所述hAMSCs的分离步骤包括：无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D‑Hanks液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约1mm³碎块，加入胰蛋白酶37℃消化10分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入II型胶原酶消化液，37℃消化30分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；1000转/分钟离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为1×10⁶/ml，接种至培养瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培养基；置37℃、饱和湿度、体积分数5％的CO₂培养箱内培养；倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液1次，并摄片记录；待细胞汇合度达80％后，用0.25％胰蛋白酶‑0.02％EDTA溶液于37℃消化2‑3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以1×10⁷/ml的细胞密度传代；以及传代过程中，隔日换液1次，待细胞长满70％瓶底重复以上步骤。