[发明专利]一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法

摘要

本发明涉及一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，该方法包括以下步骤：⑴毛细管柱内壁修饰；⑵配制含TBE的聚环氧乙烷筛分介质；⑶收集血液样品；⑷血液样品中基因组DNA提取；⑸将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5分别设计p53、k-ras、APC和C-myc基因目的片段扩增引物，得到p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品、APC基因PCR扩增样品和C-myc基因PCR扩增样品；⑹将p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品、APC基因PCR扩增样品或C-myc基因PCR扩增样品进行变性或进行内切酶，得到变性DNA样品溶液或酶切DNA样品溶液；⑺变性DNA样品溶液或酶切DNA样品溶液进行CE-SSCP或CE-RFLP检测；⑻计算CE-SSCP或CE-RFLP检测突变率之和，即得累积突变率。本发明操作简单、重现性好，可起到消化道肿瘤诊断预警作用。

主权项

1.一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤：⑴毛细管柱内壁修饰：将内径为50~75um的毛细管内壁用0.15~0.2mol/L NaOH清洗后，依次将γ-甲基丙烯酰基-三（甲氧基）硅烷/甲醇溶液和质量浓度为3.4%丙烯酰胺单体溶液充填入毛细管柱内进行共价涂层修饰；⑵含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2.5~3.5%、pH值为7.5~9.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.22~0.45um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧乙烷筛分介质；⑶血液样品收集：分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2~3ml，该收集血液样品全部采用pH值为8.0且2 mmol/L的EDTA抗凝，-80℃分装保存；⑷血液样品中基因组DNA提取：在所述步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55~57℃水浴孵育2~6h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA；所述Tris缓冲液Ⅰ与所述血液样品的体积比为1：2~3；所述Tris缓冲液Ⅱ与所述血液样品的体积比为1：0.5~1；所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1：0.03~0.05；所述酚-氯仿与所述血液样品的体积比为1：1~1.5；所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为1：1.5~2.0；⑸需检测基因目的片段扩增：将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5分别设计p53、k-ras、APC和C-myc基因目的片段扩增引物，针对同一所述血液样品中的不同基因进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品、APC基因PCR扩增样品和C-myc基因PCR扩增样品；⑹样品处理：将所述p53基因PCR扩增样品、所述k-ras基因PCR扩增样品、所述APC基因PCR扩增样品或所述C-myc基因PCR扩增样品分别进行变性，经94~97℃变性8~10min后，冰浴5~10min，得到变性DNA样品溶液；或分别在所述p53基因PCR扩增样品、所述k-ras基因PCR扩增样品、所述APC基因PCR扩增样品和所述C-myc基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液、内切酶，其中p53基因加入的内切酶为248密码子MspⅠ或282密码子SmaⅠ，k-ras基因加入的内切酶为BstNⅠ，APC基因加入的内切酶为 RsaⅠ，C-myc基因加入的内切酶为EcoRⅤ；在37℃孵育4~8h，在80℃灭活15~20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述PCR扩增样品、三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1：1.5~1.8：0.2~0.3；所述PCR扩增样品与内切酶的体积比为1：0.1~0.2； ⑺样品检测：取所述变性DNA样品溶液或所述酶切DNA样品溶液17~22ul，加入10×SYBR Green荧光染料，混匀后再分别加入去离子水至体系为30~50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10~20kv、温度为15~20℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行高效毛细管电泳-单链构象多态性或高效毛细管电泳-限制性片段长度多态性检测；⑻统计所述步骤⑺中检测结果，计算p53、APC、C-myc和K-ras基因高效毛细管电泳-单链构象多态性或高效毛细管电泳-限制性片段长度多态性检测突变率之和，即得累积突变率。