[发明专利]一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法

摘要

本发明提出了一种大规模PCR快速制备线性DNA的方法，它是在中国专利（ZL201010229160.5）低成本获得高特性DNA聚合酶RKOD的基础上，利用优化的PCR程序建立了高于常规PCR体积50-1200倍的大规模PCR方法，利用本发明获得PCR产物的浓度可达300μg/mL。在该发明中，PCR体系中的dNTPs、引物和PCRbuffer参照常规PCR浓度加样，质粒模板的浓度为1μg/mL，DNA聚合酶的用量为10U/mL，大规模PCR步骤为：(1)将反应体系置于98℃水浴0.5min；(2)72℃水浴1min；(3)将步骤(1)(2)进行40个循环，回收PCR产物。利用本发明能够实现线性DNA低成本、高速率、大规模的生产，可为进一步低成本、高效快速制备线性DNA疫苗应对新发传染病奠定基础。

主权项

一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法，其特征在于制备步骤为：1）利用专利ZL201010229160.5制备菌株，接种于50mLBMGY培养基中，制备耐高温特性DNA聚合酶RKOD；所述的LBMMY培养基配方：2%Tryptone，1%Yeast Extract，0.34%YNB，1%（NH4）2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0，1%甘油；2）根据待扩增目的靶基因序列，利用Genetool 分析软件按照碱基互补配对的原则设计获得目的基因两端20‑50nt的正反向引物序列，并用化学方法合成；3）按下表配制大小不同反应体系总体系50μL5mL20mL60mL120mL10×Buffer5μL500μL2mL6mL12mLdNTPs(2.5mM)4μL400μL1.6mL4.8mL9.6mLPrimer F(10μM)1μL100μL0.4mL1.2mL2.4mLPrimer R(10μM)1μL100μL0.4mL1.2mL2.4mL质粒模板0.05μg5μg20μg60μg120μgH2O39μL3.9mL15.6mL46.8mL93.6mLRKOD酶0.5U50U200U600U1200U确定反应体系后，在聚乙烯封口袋中依次加入H2O、PCR buffer、dNTPs、正反引物、质粒模板和DNA聚合酶等体系成分，然后用封口器将封口袋制备成一个简易的密闭容器；混匀PCR反应混合物，各成分的最终浓度分别为：dNTPs的浓度为0.2mM、正、反引物的浓度为0.2μM、质粒模板的浓度1μg/mL、包含2mM Mg2+的1×反应buffer、DNA聚合酶10U/mL；4）先调制好98℃和72℃两个恒温水浴锅，然后将装有PCR反应混合物的密闭聚乙烯封口袋顺次置于a)  98℃水浴0.5min， b）72℃水浴1min，c) 将步骤a)和b）依次进行40～45个循环，收集PCR产物并利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。