[发明专利]一种嗜热链球菌噬菌体抗性突变体筛选方法

摘要

本发明公开了一种嗜热链球菌噬菌体抗性突变体筛选方法，涉及发酵乳制品工业中的嗜热链球菌遗传育种技术。本发明是：①敏感菌株的次级培养与菌体浓缩；②高噬菌体浓度下的培养驯化与梯度稀释初筛；③噬菌体抗性突变体的复筛、确认。与现有技术相比，本发明克服了嗜热链球菌噬菌体抗性突变体筛选工作量大、效率低、突变体菌株生产性能不佳等技术难题，获得噬菌体抗性突变体概率大大增加；抗性分离率提高；菌株生产性能良好。适合于发酵乳制品工业中的嗜热链球菌遗传育种。

主权项

一种嗜热链球菌噬菌体抗性突变体菌株筛选方法，其特征在于：①敏感菌株的次级培养与菌体浓缩在一定体积的培养基中接入嗜热链球菌敏感菌株，培养至对数生长初期，按MOI≥1接入纯化的噬菌体裂解液，培养至裂解完全，继续培养进行次级生长，通过离心方法进行未裂解菌体的浓缩与收集；②高噬菌体浓度下的培养驯化与梯度稀释初筛将步骤①中的浓缩菌体接入较小体积的培养基质中，并同时接入纯化的高浓度噬菌体裂解液，培养、驯化1～20次，梯度稀释后涂平板，获得单菌落，得BIMs的初筛；③BIMs的复筛、确认初筛得到的BIMs经浊度试验、产酸抑制试验进行复筛、抗噬菌体性能确认；所述步骤①中的培养基指供嗜热链球菌生长、繁殖用的必需营养基质，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐以及维生素和水，其较佳地为LM17或LM17‑Ca培养基；所述步骤②中的培养基质指供嗜热链球菌生长繁殖、发酵产酸所用的营养基质，其可以是步骤①中所述的培养基，也可以制作酸奶、奶酪所用的各种乳原料，如生牛乳、脱脂乳粉和乳清蛋白粉；所述步骤②中的梯度稀释涂平板初筛是M17固体培养基涂平板，或是双层琼脂平板法；所述步骤③中的浊度试验为验证菌株是否对噬菌体敏感的一种方法，按MOI≥1，将噬菌体裂解液接入对数生长的供试嗜热链球菌LM17‑Ca液体培养基中，以不含噬菌体的供试嗜热链球菌LM17‑Ca液体培养基为对照，37～42℃培养，比较两者的浑浊度，如实验组、对照组均为浑浊，说明供试菌株对噬菌体不敏感，如对照组浑浊，实验组澄清，说明供试菌株对噬菌体敏感；所述步骤③中的产酸抑制试验是验证菌株是否对噬菌体敏感的另一种方法，其以添加噬菌体是否抑制嗜热链球菌发酵产酸判断菌株对噬菌体是否敏感；所述MOI为感染复数，是感染时病毒与细胞数量的比值；所述BIMs为噬菌体抗性突变体；所述抗性分离率为噬菌体抗性菌株与假设噬菌体抗性菌株的比值。