[发明专利]大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法

摘要

大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，涉及一种大豆内生细菌多样性的分析方法。是要解决传统培养方法不能全面、准确反映大豆内生细菌的种群结构、细菌多样性的问题。方法：一、大豆根表面的清理及灭菌；二、提取的大豆根的总DNA；三、大豆根总DNA的纯化；四、以大豆根总DNA为模板，进行第一次PCR扩增，纯化得产物A；五、以产物A为模板，进行第二次PCR扩增，纯化得产物B；六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，确定变性剂浓度梯度为30％～70％；七、水平电泳，电泳结束后染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法。用于分析大豆内生细菌多样性。

主权项

大豆内生细菌多样性的PCR‑DGGE分析方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、大豆根表面的清理及灭菌；二、采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA；三、大豆根总DNA的纯化；四、以纯化后的大豆根总DNA为模板，以799F和1492R为引物，进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A；五、在引物968F的5’端加上40bp含GC碱基的片段，然后以产物A为模板，采用添加了GC碱基片段的引物968F和1378R为引物，进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B；六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向DGGE胶的加样孔中加入200μL产物B，在180V电压下，电泳3h，最终确定变性剂浓度梯度为30％～70％；七、使用变性梯度凝胶电泳装置进行水平电泳，选择变性剂浓度梯度为30％～70％，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向每个加样孔加入10μL产物B，在180V电压下，电泳6h，电泳结束后对DGGE胶进行染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR‑DGGE分析方法；其中步骤四中第一次PCR扩增所用引物799F序列为5’‑AACAGGATTAGATACCCTG‑3’，引物1492R  序列为5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’；步骤五中引物968F序列为5’‑AACGCGAAGAACCTTAC‑3’，引物1378R序列为5’‑CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG‑3’，引物968F的5’端加上的碱基片段为CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。