[发明专利]人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，采用胰酶联合弹性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁、密度梯度离心及Anti-CD14磁珠分选纯化获得人肺泡II型上皮细胞。本发明建立了一套分离、培养及鉴定人肺泡II型上皮细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的人肺泡II型上皮细胞，并较持久地维持细胞生特学特性，从而为进一步深入研究肺泡II型上皮细胞的增殖、分化、液体转运、合成分泌及其在肺损伤、修复等病理生理情况下的功能变化提供了可能。

主权项

一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将手术切除边缘肺组织剪碎，BSS洗涤，经细胞筛过滤，留取筛网上组织；(2)加入25‑35ml组织消化液，36‑38℃消化35‑55min，在后10‑20分钟加入1‑2ml浓度为104U/mL的Dnase I；每L所述组织消化液的组成为：浓度为105U/mL的胰酶2‑3ml，浓度为44.5mg protein/mL的弹性蛋白酶200‑500ul；(3)加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化，滴管吹打，得到细胞悬液；加入BSS稀释细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；每L所述抑制液的组成为：DMEM/F‑1230‑60ml，FBS10‑20ml、浓度为104U/ml的DNase I1‑2ml；(4)采用36‑38℃预热的粘附培养基重悬细胞，置于36‑38℃、3‑5％CO2、相对温度90‑95％的环境下培养2‑3h，轻柔收取未贴壁的细胞再次差速贴壁2‑3h；每L所述粘附培养基的组成为：DMEM/F‑1222.5‑45ml、SAGM22.5‑45ml、FBS5‑10ml、浓度为104U/ml的DNase I1‑2ml；(5)离心收集未贴壁细胞，用DMEM/F‑12重悬细胞，并吹打均匀，缓慢加入轻、重分离液的顶部，密度梯度离心；所述轻、重分离液的体积比为1∶1；所述轻、重分离液的密度分别为1.040g/ml和1.089g/ml；(6)滴管吸出轻、重分离液界面处的细胞层，BSS洗涤；Anti‑CD14MicroBeads分选去除巨噬细胞，得到分选液；(7)离心分选液收集细胞，用36‑38℃预热的含1％FBS的SAGM重悬细胞，吹打均匀后加入SAGM完全培养基中，在36‑38℃、3‑5％CO2、相对温度90‑95％的环境中培养55‑75h后换SAGM完全培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得人肺泡II型上皮细胞。