[发明专利]猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒

摘要

本发明为一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，该试剂盒内包含有抗体检测板、样品稀释液、酶标抗原、洗涤液、底物显色液、终止液、阳性血清和阴性血清。本试剂盒的抗体检测板所包被的Cap蛋白为PCV2的真核表达核衣壳Cap蛋白，同时使用该Cap蛋白偶联的酶标抗原，使非特异性反应大为减少，提高了抗体检测的准确度，更利于大规模的推广使用。

主权项

一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于以GenBank中PCV2‑TJ毒株基因序列为模板表达PCV2型核衣壳Cap蛋白，并通过如下步骤完成猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒的制备，具体步骤如下：1)抗体检测板包被抗原的制备：以GenBank中PCV2‑TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对特异性引物，上游引物：5’‑GTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGC‑3’；下游引物：5’‑GTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT‑3’，在两条引物的5’端分别加入FokI和SalI酶切位点，以PCV‑2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV‑2的Cap蛋白全基因，通过设计的FokI/SalI双酶切位点，将目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表达载体pP‑secSUMO3中，转入大肠杆菌JM109，用PCR和双酶切方法鉴定得到重组菌株pP‑secSUMO3‑Cap，其中的阳性重组质粒经纯化、线性化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115，Zeocin浓度梯度筛选高拷贝菌株，挑取单克隆菌培养，SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌，最后将重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化分离后，加入SUMO蛋白酶同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后制得制得PCV2型核衣壳Cap蛋白。2)抗体检测板的制备：将制备的包被抗原Cap蛋白加入到0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液中进行稀释，以每孔包被浓度为1ug/ml的量分别加入96孔抗体检测板中，4℃包被过夜，用含体积浓度0.05％吐温‑20的pH7.4的1mol/L PBS溶液洗涤三次，再用质量分数为5％的脱脂奶粉在37℃下封闭2小时，用以上PBS溶液洗涤三次，在室温下风干，包装。3)酶标抗原的制备：在5mg/ml的辣根过氧化物(HRP)溶液中，加入0.2ml的0.1mol/L的NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，加入20μl 0.2mol/L pH9.5 的碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0，然后立即加入2mlCap蛋白至1ml 0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，室温搅拌2小时，回放0.1ml的4mg/ml NaBH4溶液，在搅拌下加入等体积的硫酸铵，放置1小时后3000rpm离心30分钟，弃上清，将沉淀溶于pH7.4的0.15mol/L PBS中，将PBS进行透析，12000rpm离心离30分钟，去除沉淀，上清即为所需的酶标抗原。4)底物显色液的制备：将0.2g四甲基联苯胺(TMB)溶解在100ml二甲基亚砜(DMSO)溶液中，定容至1L，即为底物显色A液；将9.33g柠檬酸和14.6g磷酸氢二钠加入到质量体积比为0.75％的过氧化氢尿素6.4ml中，调pH值到5.0，定容至1L，即为底物显色B液。将底物显色A液与B液等体积混合，量取111.2ml的18mol/L浓硫酸，用混合显色液将其稀释定容至1000ml。5)样品稀释液的制备：配制pH7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。6)洗涤液的制备：配制含体积浓度0.5％吐温‑20的pH7.4的1mol/L PBS溶液做为10倍浓缩的洗涤液。7)终止液的制备：配制2mol/L硫酸溶液。8)阳性血清和阴性血清的制备：标准的PCV2型抗体阳性和阴性血清。