[发明专利]一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物量的方法

摘要

一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物量的方法，属于微生物遗传育种方法。该方法包括步骤：（1）灵芝原生质体制备；（2）亚硝酸诱变灵芝原生质体、原生质体再生；（3）接种花生粕斜面培养基培养，该培养基由玉米、花生粕、KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB2组成；（4）接种花生粕液体发酵培养基培养，该培养基由玉米、花生粕、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O组成；（5）获得生物量和多糖、三萜类化合物等活性产物。优点：（1）本发明首次经诱变获得了菌丝生长速度快、生物量高的灵芝菌株；（2）采用的花生粕斜面培养基较马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基更有利于灵芝菌丝快速生长；（3）采用的花生粕液体发酵培养基更有利于获得较高的生物量。

主权项

一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物量的方法，其特征是：采用灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、液体摇瓶培养后，利用复合酶液水解灵芝菌丝体，在28~32℃下振荡1.5~4h，制备原生质体，采用亚硝酸作为诱变剂，诱变灵芝原生质体，选择生长速度快、菌丝雪白的再生菌落经花生粕斜面培养基、花生粕液体发酵培养基培养，获得生物量和多糖、三萜类化合物；具体步骤如下：（1）配制马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基：按照GB4789.15—2010《食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母计数》配制，用于菌种的复苏及保存；（2）菌种活化：取灵芝No. 5.786菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上活化1~2次；（3）取液体培养的菌丝，过滤收集菌丝球，用无菌水冲洗2~3次，再用甘露醇冲洗2~3次，转入巯基乙醇中，恒温摇床振荡30~60min，过滤收集菌丝球，用甘露醇冲洗2~3次，离心分离取沉淀为菌丝体，取菌丝体以1:10~20的比例加入复合酶液，恒温下振荡酶解2~4h，过滤后滤液于500~1000r/min离心3~5min，取上清液于3000~4000 r/min，离心5~10 min，沉淀即为原生质体，用甘露醇冲洗并用0.9％生理盐水把原生质体稀释10~15倍；（4）向原生质体稀释液中加入等量的0.06mol/LNaNO2和1mol/L醋酸缓冲液，27℃恒处理5~25min，再加入两倍于醋酸缓冲液体积的0.7mol/L pH 8.6的Na2HPO4溶液终止诱变；将诱变后的原生质体分别涂在再生培养基上，27℃培养5天；（5）将生长速度快、菌丝雪白的菌落接种在花生粕斜面培养基上，该培养基组成为玉米10~30g/L，花生粕2~5g/L，KH2PO4 1~3 g/L，MgSO4·7H2O 0.5~1.5 g/L，VB2 0.3~0.8g/L，琼脂20g/L。