[发明专利]猪附红细胞体分离纯化的方法

摘要

本发明公开了一种猪附红细胞体分离纯化的方法，包括病原的分离纯化，37℃溶血，蔗糖层析的步骤，最后在收集的提纯物中加入PBS缓冲液，4℃10000r/min离心2h去蔗糖，弃上清，沉淀用2ml的PBS缓冲液悬浮，分装后-20℃保存备用。本发明在无菌采集到血样后，首先用PBS缓冲液进行了冲洗，初步分离纯化了血样，排除了干扰物质，为后续的分离纯化奠定基础；采用了56℃水浴加热使附红细胞体脱离于红细胞的物理学方法，既不影响附红细胞体的活性，同时也可以多次分离，从而可以获得更多的抗原量；在附红细胞体脱离红细胞后，又采用了蔗糖层析的方法进一步纯化附红细胞体，使获得的抗原的纯度增加。

主权项

一种猪附红细胞体分离纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤：一、病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样1ml,4℃或冷冻保存，于采集的临床血样中加入3倍0.01mol/L、pH为7.4的PBS清洗，2000r/min离心10min，去上清液，于沉淀中加入1倍的PBS稀释，56℃水浴3min，立即2000r/min离心10min，弃沉淀，取上清于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4℃或－20℃保存备用；二、对经56℃水浴分离的富含附红细胞体的沉淀中按1:2比例加入灭菌蒸馏水，置于37℃溶血10min；三、将灭菌的蔗糖用PBS缓冲液配制成2个梯度，在离心管中从下到上依次加入55%和20%的蔗糖溶液，将经过超离的粗提液3ml小心加入在20%的蔗糖液上面，4℃12000r/min离心2h，最后用灭菌注射器小心吸取55%和20%的蔗糖段之间的附红细胞体带；四、在收集的提纯物中加入PBS缓冲液，4℃10000r/min离心2h去蔗糖，弃上清，沉淀用2ml的PBS缓冲液悬浮，分装后‑20℃保存备用。