[发明专利]一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法

摘要

本发明公开了一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法，第一次PCR设计引物时，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500bp处的序列50nt加pKD267上的序列20nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)；第二次PCR设计引物时，分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA；两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆。

主权项

一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：A1，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500bp处的序列50nt加pKD267上的序列20nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)，采用电转法将PCR产物转化入目的菌，该目的菌已经被提前转入pKD46，并在30℃条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶，以卡那抗性筛选阳性克隆；A2，分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA；进行两次PCR，引物5a‑RECO‑RED和luxS‑RECO‑RED扩增luxS上游500bp和luxS基因，在起始密码ATG的互补链上引入点突变AAA；引物3a‑RECO‑RED和luxS‑5a‑RED扩增luxS下游500bp和luxS基因，在编码链起始密码ATG处引入点突变AAA；A3，步骤A2中的两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆；第三次PCR采用引物对：5a‑RECO‑RED：5’‑CCCAAAGTCGGGAAAGATC‑3’、3a‑RECO‑RED：5’‑CGAATTTGCGCCTCGGCATC‑3’。