[发明专利]一种离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体及其应用方法

摘要

本发明提出一种离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体及其应用方法，重组表达载体步骤为：设计4条引物，分别加在pINA1296载体的启动子上游和终止子下游，分别PCR扩增包括以启动子和终止子为区域的小片段及以载体的其他框架为区域的大片段，经回收纯化后，转化大肠杆菌XL10-Gold；验证重组子，得用于多拷贝解脂耶氏酵母表达载体pINA1296I。应用方法为：选择需表达的目的基因，将目的基因插入pINA1296I载体中，组成新的含有目的基因的单拷贝重组质粒pINA1296I-xxx-A1。再利用生物砖方法来实现体外串联多拷贝目的基因，pINA1296I-xxx-A2，pINA1296I-xxx-A3，pINA1296I-xxx-A4等。本发明安全、简单、易操作，可以提高目的蛋白的表达量。

主权项

一种离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体，其特征在于步骤为：1）查找pINA1296载体的启动子和终止子区域及构成载体的其它元件，其中利用的同尾酶分别加在启动子上游和终止子下游，然后设计4条引物（5'agcaccAAGCTTGCTAGCgccgccgcaaggaatggt 3'、5'gaattcGGATCCTCTAGAggacacgggcatctcacttgca3'、5'TCTAGAGGATCCgaattctcatgtttgacagcttatcatcg3'、5'GCTAGCAAGCTTggtgctcaacggcctcaacctac 3'），分别PCR扩增包括以启动子和终止子为区域的小片段及以载体的其他框架为区域的大片段，大片段和小片段大小分别为1065bp和6164bp左右通过PCR的方法获得两个大小不同的片段后，产物经过琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，再用DpnI 37°C消化3h以消除质粒背景，将两个片段混合通过无酶克隆的方式转化大肠杆菌XL10‑Gold；所述PCR方法的条件为98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 30cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存；2）转化的大肠杆菌XL10‑Gold  37 °C生长12 h后，从平板随机挑取单菌落，小量提取质粒DNA与原始的pINA1296进行大小比对，初步确定为所需的重组子，命名为pINA1296I，该pINA1296I即为新改造构建的用于多拷贝解脂耶氏酵母表达载体；3）验证重组是否成功。