[发明专利]一种重组甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制备甘露寡糖的方法

摘要

本发明提出了一种重组甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制备甘露寡糖的方法，其步骤为：1）根据毕赤酵母密码子偏爱性，优化重组β-甘露聚糖酶基因；2）构建含有重组β-甘露聚糖酶基因的表达载体pHBM905BDM-Man，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，培养验证得单拷贝基因工程菌；3）构建培养验证多拷贝的基因工程菌；4）用不同拷贝数的基因工程菌高效表达制备重组β-甘露聚糖酶；5）用重组β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖底物生产甘露寡糖，底物水解浓度15-40%，温度50-55℃，时间0.5-2小时。目前，两拷贝β-甘露聚糖酶基因工程菌GS115/MAN78（CCTCCNo：2012554）表达水平较高。本发明重组β-甘露聚糖酶活性高达5000U/mL（DNS法），水解底物特异性高，水解底物浓度明显高于其他方法。

主权项

一种重组甘露聚糖酶基因，其特征在于：优化后的序列为：atgttgccaa aggcttctcc agccccatcc acttcttcta gtgccgcctc tacatctttt 60gcatctactt ctggcttgca gtttactatt gatggtgaaa ctggttattt tgctggtact 120aactcttact ggattggttt tttgactgat aacgctgatg ttgatttggt catgggtcat 180ttgaagtctt caggattgaa gattttgaga gtttggggtt ttaacgatgt cacttctcaa 240ccatctagtg gtactgtttg gtatcaacta catcaggatg gcaagtctac tattaacaca 300ggtgctgacg gtttgcagag attggattac gttgtcagtt cagccgaaca gcacgatatc 360aaacttatca taaacttcgt gaattattgg acagactacg gcggcatgtc tgcatacgtt 420tctgcttacg gtggatctgg tgagactgat ttttacactt ctgacactat gcaaagtgct 480taccagacct acattaagac agttgtcgag cgttactcta attcctctgc tgtttttgct 540tgggaattgg ctaacgaacc aagatgtcct tcttgcgata cttcagtcct atataactgg 600atcgagaaga cctctaagtt catcaagggc ttggacgccg atagaatggt ttgtattggt 660gacgaaggtt ttggtttgaa tattgactcc gatggttctt acccatacca attctctgaa 720ggtctgaact ttaccatgaa cctaggcata gatactatcg actttggaac tctgcacttg 780tatccagatt catggggtac gtctgatgat tggggtaatg gctggatcac cgctcatgga 840gccgcctgca aggcagctgg taaaccttgt ttgttggagg aatacggtgt aacatctaat 900cactgttctg tggaaggttc ttggcagaag actgctttgt ctaccactgg tgtgggagct 960gatttgtttt ggcagtacgg agacgatttg agtactggaa agtctcccga tgatggtaac 1020acaatttact acggtacttc cgactatcag tgcttggtta cagatcatgt tgcagctatc 1080ggttctgct 1089设计的引物序列为：man‑1GTCAATGTTGCCAAAGGCTTCTCCAGCCCCATCCACTTCTTCTAGman‑2TAGATGCAAAAGATGTAGAGGCGGCACTAGAAGAAGTGGATGGGGC 46man‑3GCCTCTACATCTTTTGCATCTACTTCTGGCTTGCAGTTTACTATTG 46man‑4CAGCAAAATAACCAGTTTCACCATCAATAGTAAACTGCAAGCCAGA 46man‑5GGTGAAACTGGTTATTTTGCTGGTACTAACTCTTACTGGATTGGTT 46man‑6ACATCAGCGTTATCAGTCAAAAAACCAATCCAGTAAGAGTTAGTAC 46man‑7TTTTGACTGATAACGCTGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAA 46man‑8TCTCAAAATCTTCAATCCTGAAGACTTCAAATGACCCATGACCAAA 46man‑9TCTTCAGGATTGAAGATTTTGAGAGTTTGGGGTTTTAACGATGTCA 46man‑10ACAGTACCACTAGATGGTTGAGAAGTGACATCGTTAAAACCCCAAA 46man‑11TCAACCATCTAGTGGTACTGTTTGGTATCAACTACATCAGGATGGC 46man‑12AGCACCTGTGTTAATAGTAGACTTGCCATCCTGATGTAGTTGATAC 46man‑13AGTCTACTATTAACACAGGTGCTGACGGTTTGCAGAGATTGGATTA 46man‑14GTGCTGTTCGGCTGAACTGACAACGTAATCCAATCTCTGCAAACCG 46man‑15ACTTCAGCCCAACAGCACCATATCAAACTTATCATAAACTTCCTGA 46man‑16CGCCCTAGTCTCTCCAATAATTCACGAAGTTTATCATAAGTTTGAT 46man‑17TATTCGACAGACTACGGCGGCATGTCTGCATACGTTTCTGCTTACG 46man‑18TAAAAATCAGTCTCACCAGATCCACCGTAAGCAGAAACGTATGCAG 46man‑19GGATCTGGTGAGACTGATTTTTACACTTCTGACACTATGCAAAGTG 46man‑20CTGTCTTAATGTACGTCTGCTAAGCACTTTGCATAGTGTCAGAAGT 46man‑21CTTACCAGACCTACATTAAGACAGTTGTCGAGCGTTACTCTAATTC 46man‑22AATTCCCAAGCAAAAACAGCAGAGGAATTAGAGTAACGCTCGACAA 46man‑23TGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCTTCT 46man‑24AGTTATATAGGACTGAAGTATCGCAAGAAGGACATCTTGGTTCGTT 46man‑25CCCATACTTCACTCCTATATAACTGCATCGAGAAGACCTCTAAGTT 46man‑26CTATCCGCGTCCAAGCCCTTGATGAACTTAGACGTCTTCTCGATCC 46man‑27GGCTTCGACGCCGATAGAATGGTTTGTATTGGTGACGAAGGTTTTG 46man‑28AACCATCGGAGTCAATATTCAAACCAAAACCTTCGTCACCAATACA 46man‑29TTTGAATATTGACTCCGATGGTTCTTACCCATACCAATTCTCTGAA 46man‑30ACGTTCATGCTAAAGTTCACACCTTCAGAGAATTCGTATGCGTAAG 46man‑31GTCTGAACTTTACCATGAACCTAGGCATAGATACTATCGACTTTGG 46man‑32AATCTCGATACAAGTGCAGAGTTCCAAAGTCGATAGTATCTATGCC 46man‑33ACTCTGCACTTGTATCCAGATTCATGGGGTACGTCTGATGATTGGG 46man‑34TCCATGAGCGGTGATCCAGCCATTACCCCAATCATCAGACGTACCC 46man‑35TCCATCACCCCTCATGGAGCCGCCTCCAACGCAGCTCGTAAACCTT 46man‑36ATGTTACACCGTATTCCTCCAACAAACAAGGTTTACCAGCTGCCTT 46man‑37TGGAGGAATACGGTGTAACATCTAATCACTGTTCTGTGGAAGGTTC 46man‑38TGGTAGACAAAGCAGTCTTCTGCCAAGAACCTTCCACAGAACAGTG 46man‑39AGAAGACTGCTTTGTCTACCACTGGTGTGGGAGCTGATTTGTTTTG 46man‑40AGTACTCAAATCGTCTCCGTACTGCCAAAACAAATCAGCTCCCACA 46man‑41TACGGAGACGATTTGAGTACTGGAAAGTCTCCCGATGATGGTAACA 46man‑42ATAGTCGGAAGTACCGTAGTAAATTGTGTTACCATCATCGGGAGAC 46man‑43TTTACTACGGTACTTCCGACTATCAGTGCTTGGTTACAGATCATGT 46man‑44AGCAGAACCGATAGCTGCAACATGATCTGTAACCAAGCACman‑45GGCCATTAATGGTGATGGTGATGGTGAGCAGAACCGATAGCTGCAACAT利用套叠PCR的方法合成该重组β‑甘露聚糖酶基因，设计的引物长度为40‑50bp，相邻两引物之间有20bp左右重叠序列，Tm值为55‑60℃。