[发明专利]超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用

摘要

本发明涉及被称作Tat相关蛋白质改造工程(TAPE)的方法，通过将靶蛋白和抗生素抗性蛋白连接到Tat信号序列并在大肠杆菌内表达它，筛选具有更高的溶解性和优异的热稳定性的靶蛋白，特别是源自人生殖细胞的免疫球蛋白可变结构域(VH或VL)，以及由TAPE法筛选的、具有溶解性和优异的热稳定性的、人或改造的VH和VL结构域抗体和人或改造的VH和VL结构域抗体支架。还提供了在由TAPE法筛选的人或改造的VH或VL结构域抗体支架中包括随机CDR序列的文库，以及其制备方法。海通了使用该文库筛选的具有靶蛋白质结合能力的VH或VL结构域抗体，包括该结构域抗体的药物组合物。

主权项

一种筛选可溶性靶蛋白的方法，所述方法包括：(1)用Tat相关蛋白质改造工程载体pET‑TAPE表达编码融合蛋白的基因构建体，所述基因构建体包含连接到靶蛋白的N末端的Tat底物蛋白大肠杆菌三甲胺‑N‑氧化物还原酶即TorA的途径信号序列和连接到靶蛋白的C末端的TEM‑1β‑内酰胺酶，将所述基因构建体转化至包含一种或多种宿主细胞的宿主细胞群中；(2)接种所述宿主细胞群于含有抗生素的液体培养基中；(3)从所述含有抗生素的液体培养基选择存活的宿主细胞以收集质粒DNA；(4)从收集的质粒DNA中收集编码靶蛋白的核酸序列；(5)从收集的核酸序列中确认并筛选靶蛋白的序列；和(5’)再次用pET‑TAPE载体转化宿主细胞，向所述pET‑TAPE载体引入了所收集的核酸序列，或(5”)直接用含有所收集的核酸序列的收集的质粒转化宿主细胞，而不制备单独的pET‑TAPE载体，其中所述可溶性靶蛋白是免疫球蛋白可变结构域或抗体片段。