[发明专利]一种甲醇蛋白发酵滤液再利用的方法

摘要

本发明涉及甲醇蛋白发酵滤液再利用的方法，有效解决单细胞甲醇蛋白工业化生产中发酵液的循环再利用问题，将按常规方法或用巴斯德毕赤酵母HGD-01生产甲醇蛋白所得的发酵液静置，沉降离心，过滤，过滤液回收利用，每一次回收利用过程中在过滤液内加乙二胺四乙酸的量依次递增，用过滤液和乙二胺四乙酸混配成混合液，混合液与无机盐发酵培养基中的无机盐混配成替代培养基，本发明减少了无机盐投入，降低废水排放，节约水资源，降低原料成本，不影响酵母细胞的生长和甲醇蛋白产率，提高生产效率。

主权项

一种甲醇蛋白发酵滤液再利用的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、摇瓶种子培养：分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD‑01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342；将甘油管保藏的0.5mL巴斯德毕赤酵母HGD‑01的菌株用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，即得斜面种子；取1支培养好的斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有250mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养约24～30小时后，菌体OD600达到3～5，获得摇瓶种子；所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；2）、一级种子培养：A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，按步骤1）所述方法在50L罐中配制30L的YPD液体培养基，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对YPD液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，通高温蒸汽灭菌10min，灭菌结束后，打开冷却水阀门，使冷确水进发酵罐夹套层，对培养基进行降温，当培养基温度降至30℃时，开始接种；B、将摇瓶种子1000mL接种到50L发酵罐内的YPD液体培养基中，温度28～30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养20～24h后，得一级种子；3）、二级种子培养：将3m3的BSM无机盐发酵培养基放入5m3发酵罐中，用2）A步骤中对YPD液体培养基相同的灭菌方法对BSM无机盐发酵培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调BSM无机盐发酵培养基pH值至4.8～5.0，然后将30L一级种子通过压力管道接种到5m3发酵罐内pH值为4.8～5.0的BSM无机盐发酵培养基中，接种时罐压为0.05‑0.10MPa，培养时，培养温度30～32℃，通风比1：1~1.5 vvm，罐压0.05MPa，pH5.0～5.5，培养24~30h，得二级种子；所述的BSM无机盐发酵培养基为：质量浓度为85%磷酸25kg/m3、磷酸氢二钾0.5kg/m3、氯化铵0.3kg/m3、二水硫酸钙0.2kg/m3、氯化钠0.5kg/m3、硫酸钾3kg/m3、七水硫酸镁2kg/m3、甘油25kg/m3和微量元素溶液4L/m3加水制成，也就是说BSM无机盐发酵培养基为：质量浓度为85%磷酸25kg、磷酸氢二钾0.5kg、氯化铵0.3kg、二水硫酸钙0.2kg、氯化钠0.5kg、硫酸钾3kg、七水硫酸镁2kg、甘油25kg和微量元素溶液4L加水至1m3；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜1.5g/L、碘化钾0.02g/L、一水硫酸锰0.5g/L、二水钼酸钠0.2g/L、硼酸0.02g/L、六水合氯化钴0.3g/L、氯化锌20g/L、七水合硫酸亚铁19g/L、质量浓度98%的浓硫酸4mL/L、生物素0.2g/L、对氨基苯甲酸0.05g/L和泛酸钙0.05g/L加水制成，也就是说微量元素溶液为：五水硫酸铜1.5g、碘化钾0.02g、一水硫酸锰0.5g、二水钼酸钠0.2g、硼酸0.02g、六水合氯化钴0.3g、氯化锌20g、七水合硫酸亚铁19g、质量浓度98%的浓硫酸4mL、生物素0.2g、对氨基苯甲酸0.05g和泛酸钙0.05g加水至1L；4）、高密度发酵：在50m3发酵罐中加入BSM无机盐发酵培养基30m3做为发酵培养基，用160℃以上的蒸汽进行灭菌，同时对与50m3发酵罐相连的管道进行灭菌，灭菌结束后，将发酵培养基温度降至30～35℃，用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基pH至4.5～5.0，然后将二级种子3m3接种到50m3发酵罐内pH为4.5～5.0的发酵培养基中进行发酵，发酵温度为30～32℃，通气量1.5～2vv/m，搅拌转速80‑200rpm，24小时后，培养基中甘油耗尽，溶氧开始上升，开始流加甲醇，用甲醇检测仪器在线监测甲醇浓度，使甲醇浓度控制在0.8%～1.2%，45‑50小时后，菌体湿重达到250‑300 g/L，OD600值达到42～45，此时发酵结束，即得发酵液； 5）、过滤液的收集：发酵液静置，沉降4～8小时，上层发酵液用卧螺离心机进行离心，离心机转速3000转/分钟，进料量5m3/h，离心清液再用板框过滤机过滤，过滤面积20m2，过滤流速1.5 m3/h，过滤得第一次过滤液和菌饼，将菌饼投入到5m3发酵储罐中，加入菌饼体积量1/5的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，调节进风口温度至140～160℃、出口温度至65‑80℃，调节进料流量为1吨/小时，喷雾干燥，收集蛋白干粉；6）、第一次发酵滤液的收集第一次过滤液中添加乙二胺四乙酸，每升第一次过滤液中EDTA添加量为0.5g/L，得第一混合液，再用质量浓度为85%的磷酸和质量浓度为35%的氨水调第一混合液pH值到5.5～6.0，得第一次发酵滤液；7）、第二次发酵滤液的收集分别取上述3）步骤中BSM无机盐发酵培养基配方中磷酸、无机盐及微量元素溶液用量10%的磷酸、10%的无机盐、10%的微量元素溶液、甘油25kg/m3和第一次发酵滤液20m3混合，加水至30m3，得第一替代培养基，备用；所述的无机盐为磷酸氢二钾0.5kg/m3、氯化铵0.3kg/m3、二水硫酸钙0.2kg/m3、氯化钠0.5kg/m3、硫酸钾3kg/m3和七水硫酸镁2kg/m3；再按上述1）、2）、3）、4）、5）、步骤中的方法和用量再次收集第二次过滤液，其中，在收集第二次过滤液的过程中，将上述第4）步骤中所用的发酵培养基替换成第一替代培养基，收集得第二次过滤液和蛋白干粉，第二次过滤液添加乙二胺四乙酸进行回收利用，即每升第二次过滤液中EDTA添加量为0.9g/L，得第二混合液，再用质量浓度为85%的磷酸和质量浓度为35%的氨水调第二混合液pH值到5.5～6.0，得第二次发酵滤液；8）、第三次发酵滤液的收集分别取上述3）步骤中BSM无机盐发酵培养基配方中磷酸、无机盐及微量元素溶液用量15%的磷酸、15%的无机盐、15%的微量元素溶液、甘油25kg/m3和第二次发酵滤液20m3混合，加水至30m3，得第二替代培养基，备用，所述的无机盐为磷酸氢二钾0.5kg/m3、氯化铵0.3kg/m3、二水硫酸钙0.2kg/m3、氯化钠0.5kg/m3、硫酸钾3kg/m3、七水硫酸镁2kg/m3；再按上述1）、2）、3）、4）、5）、步骤中的方法和用量再次收集第三次过滤液，其中，收集第三次过滤液的过程中，将上述第4）步骤中所用的发酵培养基替换成第二替代培养基，收集得第三次过滤液和蛋白干粉，第三次过滤液中添加乙二胺四乙酸进行回收利用，即每升第三次过滤液中EDTA添加量为1.3g/L，得第三混合液，再用质量浓度为85%的磷酸和质量浓度为35%的氨水调第三混合液，pH值到5.5～6.0，得第三次发酵滤液；9）、第三次发酵滤液的再利用分别取上述3）步骤中BSM无机盐发酵培养基配方中磷酸、无机盐及微量元素溶液用量20%的磷酸、20%的无机盐、20%的微量元素溶液、甘油25kg/m3和第三次发酵滤液20m3混合，加水至30m3，得第三替代培养基，备用，所述的无机盐为磷酸氢二钾0.5kg/m3、氯化铵0.3kg/m3、二水硫酸钙0.2kg/m3、氯化钠0.5kg/m3、硫酸钾3kg/m3、七水硫酸镁2kg/m3；再按上述1）、2）、3）、4）、5）、步骤中的方法和用量再次制备蛋白干粉，其中，此次制备蛋白干粉过程时，将上述第4）步骤中所用的发酵培养基替换成第三替代培养基，制备得第四次过滤液和蛋白干粉，第四次过滤液排放到污水处理车间。