[发明专利]一种脱细胞角膜的制备方法

摘要

一种脱细胞角膜的制备方法，本发明采用脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护和灭菌的步骤。所制备的脱细胞角膜抗原去除彻底，不会激起宿主获得性免疫反应，生物相容性好，对天然角膜基质的损伤小，保留了天然角膜的结构特性，也保留了天然角膜的有效成分，因此有着与天然角膜相似的物理化学特性；所制备的脱细胞角膜移植后，经动物实验显示，移植角膜透明、无瘢痕形成，不发生融解、无新生血管；移植后1个月即与植床完全融合，3个月角膜已经完全上皮化，并有角膜基质细胞向脱细胞角膜植片迁移，证明组织正在发生缓慢的改建，6个月后移植的角膜与天然角膜在组织学和外观检测中无明显差异。

主权项

一种脱细胞角膜的制备方法，包括脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护和灭菌的步骤，具体如下：步骤一、脱角膜上皮层：将哺乳动物角膜置入0.05～0.2M的乙二胺四乙酸溶液中浸泡12h，再用去离子水以振荡法溶胀角膜，使角膜达到0.2～1.5cm厚度，然后搓去角膜上皮细胞层，暴露出角膜前弹力层; 所述哺乳动物角膜的结构完整、无损伤，保留有0.1～0.5 cm宽的巩膜；步骤二、紫外交联：采用370 nm波长的紫外光，照射步骤一得到的角膜的前弹力层面20～60分钟，完成交联处理; 步骤三、病毒灭活：用刀具在角膜的后弹力层面划2～10根划痕，划痕深度＜1mm; 将角膜放入浓度为5～80mg/ml的海藻糖溶液中浸泡0.5～3h，转入含有5～80mg/ml浓度海藻糖和含70ml/100ml浓度乙醇的混合溶液中浸泡2h，再转入浓度为2～10mg/ml的海藻糖溶液中振荡清洗，直至无乙醇残留，最后用生理盐水洗净角膜基质中的海藻糖残留;步骤四、脱细胞处理：将步骤三得到的角膜置入1～5M的NaCl溶液中振荡处理0.25～4h，再转入去离子水中振荡清洗0.25～4h；然后转入20～60mM的NaOH溶液中振荡处理0.25～4h，最后用去离子水冲洗，直至洗出液pH达到4～8;步骤五、梯度脱水：将步骤四得到的脱细胞角膜置入0.05～0.2M的MgCl₂水溶液中浸泡10～60分钟; 采用在50ml/100ml～90ml/100ml范围内浓度梯度的甘油，从低浓度到高浓度对角膜进行2～3次的脱水处理，使脱细胞角膜厚度回复到天然角膜厚度; 步骤六、辐照保护和灭菌：将步骤五得到的角膜放入5～30 mg/ml浓度的甘露醇溶液中5～15分钟; 按照需要厚度，采用物理方法对角膜进行削切，去除后弹力层和部分基质层，保留前弹力层和部分基质层；真空包装后，采用15～25 kGy的钴60辐照灭菌。