[发明专利]一种洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法

摘要

本发明是一种洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法。包括以下步骤：（1）确定材料；（2）花蕾选取预处理；（3）游离小孢子分离；(4)小孢子愈伤组织诱导；（5）不定芽诱导；（6）单倍体植株获得；（7）再生植株倍性鉴定确定获得单倍体植株。通过本发明的方法可避免花药培养带来的二倍体再生植株的干扰，可获得大量单性胚状体，单倍体植株比率可达到100%，形成足够大的选择群体，经秋水仙碱处理后可成为纯合自交系。洋桔梗纯合自交系的获得为洋桔梗品种改良和新品种选育提供有力手段，用于杂交种组配可快速筛选出优良的杂交一代（F1），为解决我国洋桔梗种子生产问题，具有巨大的潜在商业价值。

主权项

一种洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法，其特征在于按以下步骤进行：（1）确定材料：选取具有综合优良性状的杂交一代洋桔梗品种作为材料； （2）花蕾选取，预处理，消毒：在开花初期，通过荧光染色法在显微镜下选取处于单核靠边期的花蕾，放入塑料袋中置于4℃冰箱1～3天，清洗花蕾表面，用酒精消毒，再用升汞消毒，最后用无菌水冲洗后，晾干；（3）游离小孢子分离：将消毒后花蕾放入含有B5培养基的研钵中研磨，混合液经400目双层漏斗过滤，收集滤液于离心管中，1000rpm离心，弃去上清，再加入5～8 mL B5培养基，1000rpm离心，清洗沉淀，重复2次，离心完毕后，加入MS液体培养基于离心管中，统计细胞密度，并调整密度为1.0×104～1.0×105个/mL，获得游离小孢子； （4）小孢子愈伤组织诱导：移取1mL含有上述小孢子的液体培养基于诱导愈伤组织的MS固液双层培养基中，温度为22～27℃进行黑暗培养；30～40天后，形成愈伤组织；所述MS固液双层培养基为：固体层：MS +0.8%琼脂粉+3％蔗糖，液体层：MS +0.1～4 mg/L KT +0.1～4 mg/L 2，4‑D+3％蔗糖，灭菌； （5）不定芽诱导：取上述愈伤组织接种于不定芽诱导培养基：MS+0.1～4 mg/L KT +0.1～0.5 mg/L IBA，光照强度为2000Lx，光照时间为8～13小时/天，温度为22～27℃进行培养；30～40天后可见愈伤组织上绿色球型小突起，50～60天后可见萌动的不定芽或丛生小苗；（6）单倍体植株获得：取上述不定芽或小苗转入培养基：MS+1 mg/L 6‑BA+0.1 mg/L NAA，光照强度为2000Lx，光照时间为8～13小时/天，温度为22～27℃进行培养；20～30天形成完整单倍体植株； （7）再生植株倍性鉴定：将上述完整植株的根尖放入浓度为0.002mol/L 的8‑羟基喹啉中1天；用移液器移出8‑羟基喹啉，再用蒸馏水冲洗根尖；将冲洗好的根尖放入到卡诺氏20～24小时，取出卡诺氏，用蒸馏水冲洗根尖，将根尖放入浓度为1mol/L的HCl中5～20min，用蒸馏水冲洗干净，用卡宝品红染色压片；显微镜观察，确定获得染色体数目2ｎ=36的单倍体植株。